同步監測蟾蜍心臟機械和電活動簡便而有效的方法*

李秀國，張民鋒，樸日龍，李迎軍

(延邊大學1基礎醫學院，2藥學院，吉林 延吉 133002)

觀察心肌收縮力、心率和心輸出量等心肌機械活動的變化，以及監測心電圖的變化對于研究各種生理或病理因素對心臟功能的影響，以及心血管藥物的開發具有重要意義?，F有很多觀察心臟功能的實驗方法，都有各自的特點。離體Langendorff心臟灌流法、離體乳頭肌實驗法、心房肌實驗法等能夠模擬哺乳動物心肌收縮，兔在體不破壞胸膜記錄心收縮力的方法能夠同時觀察心肌收縮力和心電圖的變化，但實驗設備和技術條件要求較高［1－2］。利用變溫動物離體心臟為實驗對象進行的Straub's法和八木－Hartung法蛙心插管［3］能夠直觀地觀察整體心臟收縮，具有簡單、易行，不需恒溫和供氧設備，心臟活動不受神經體液調節等優點。宋士軍等［4］的實驗方法利用在體蟾蜍心臟同步觀察了心臟的機械性活動和心電圖的變化。在同一實驗個體中能夠同步觀察多個實驗參數不僅能夠減少實驗經費，其實驗結果會更可靠。本實驗制作了蟾蜍離體原位自發性搏動心臟灌注模型，用于同步監測心輸出量、心肌舒縮張力和心電圖。通過灌注β受體激動藥異丙腎上腺素和其拮抗藥普萘洛爾，驗證了該實驗方法的可行性。

材料和方法

1 材料

蟾蜍，雌雄混用，體質量50～70 g，延邊大學實驗動物科提供。BL－420S生物機能實驗系統和張力換能器以及標準肢體心電圖Ⅱ導聯線(四川成都泰盟科技有限公司)，異丙腎上腺素、普萘洛爾(Sigma Chemical Co.)，任氏液為標準配方。

2 方法

2.1 模型制備(圖1) 蟾蜍毀腦毀髓，背位固定在蛙板上。打開胸腹腔，暴露心臟和相連大血管。分離左右主動脈干，結扎右主動脈，左主動脈穿線備用。上提左右主動脈，鈍性分離后腔靜脈，并在其下穿2條線，1條從靜脈竇下方結扎后腔靜脈和動脈干以外的其它血管，1條備用。向左翻開肝臟右葉，分離肝靜脈并輕輕提起，將裝有任氏液的連接三通管和5 mL注射器的硅膠管(外徑2 mm，內徑1.5 mm)從肝靜脈經后腔靜脈插入右心房約1.5～2.0 mm。打開三通管，并注入少量任氏液，進一步確定硅膠管進入位置。用備用絲線結扎固定插入后腔靜脈的硅膠管頭端(注意保持管道的通暢，不能有扭曲或反折，以免影響液體流出)。在三通管的垂直入口上連接儲液瓶(10 mL注射器管制成)，打開儲液瓶與注射器之間的通道，推注注射器內的任氏液進入儲液瓶，排出三通管內殘留氣體。打開儲液瓶與硅膠管之間的通道，向后腔靜脈輸入任氏液清洗心臟積血。將肝臟和心臟放回原位。提起左主動脈干，做一“V”形切口。將另一個硅膠管從切口向心臟方向插入至近動脈圓錐處，用備用絲線結扎固定(硅膠管尖端平切，利于液體流出)。回收流出液至儲液瓶。用無創蛙心夾夾住心尖并與張力換能器連接。調節儲液瓶液面高度(前負荷)為3 cmH2O，流出管口高度(后負荷)為10 cmH2O。觀察液體流出量，確定有無漏液。向蟾蜍右側頭端牽拉結扎左右腔靜脈等的絲線并固定，調節蛙心夾與滑輪的水平連線，使蟾蜍心尖保持水平向下偏左。肢體皮下插入針狀電極，利用BL－420S系統記錄心臟的張力和標準肢體Ⅱ導聯心電圖。穩定30 min，調節張力換能器，使心肌在舒張期末的張力維持在1.0 g左右。待蟾蜍心臟收縮曲線平穩后，記錄心輸出量、心肌舒縮程度和幅度，以及心電圖PR間期、QT間期、QRS波群電壓和時間等，作為自身對照。

Figure 1.A schematic diagram simultaneously detecting the cardiac contractility and electrocardiogram(ECG)on the separated in situ spontaneously beating toad heart perfusion model.a:container for perfusion;b:3－way stopcock;c:syringe for rapid application of Ringer's solution or empty the gas in the inflow cannula;d:inflow cannula;e:aortic cannula(outflow cannula);f:force transducer;g:standard limb leadⅡ;h:BL－420S data acquisition and analysis system.圖1 同步監測蟾蜍離體原位自發性搏動心臟灌流模型的機械性和電活動示意圖

2.2 利用灌流模型觀察異丙腎上腺素對心臟活動的影響在對照條件下，用10－5g/L異丙腎上腺素溶液置換儲液瓶中的任氏液，待曲線平穩后，記錄以上參數。之后，依次用5×10－5g/L、10－4g/L異丙腎上腺素溶液置換儲液瓶中液體，在曲線平穩時記錄以上參數。

2.3 利用灌流模型觀察普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響 用含10－4g/L異丙腎上腺素和含10－4g/L普萘洛爾的混合溶液置換10－4g/L異丙腎上腺素溶液，在曲線平穩時記錄以上參數。之后依次用含10－4g/L異丙腎上腺素與含5×10－4g/L和10－3g/L普萘洛爾混合溶液置換后，在曲線平穩時記錄以上參數。

3 統計學處理

結 果

1 離體原位心臟機械性活動和相應心電圖表現

在灌注任氏液的條件下，蟾蜍離體原位自發性搏動心臟張力和心電圖曲線見圖2，具體參數見表1。通過記錄出液管中的流出滴數，方便地記錄到心輸出量的變化(1 mL=20 drop);通過張力曲線圖能夠監測到心臟收縮和舒張程度、舒縮幅度;心電圖曲線中的PR間期、QT間期、QRS波群時間和電壓等顯示清楚，利于分析心臟機械性活動和電生理變化的相關性。

Figure 2.The curves of cardiac force and electrocardiogram simultaneously recorded from the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve;B:ECG curve.圖2 同步記錄蟾蜍離體原位自發性搏動心臟的張力和心電圖曲線

表1 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發性搏動心臟活動的影響Table 1.The effects of isoproterenol on the cardiac activities of the separated in situ toad hearts in the presence or absence of propranolol(.n=10)

表1 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發性搏動心臟活動的影響Table 1.The effects of isoproterenol on the cardiac activities of the separated in situ toad hearts in the presence or absence of propranolol(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pretreatment;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 10－4g/L isoproterenol.

Parameters Pretreatment isoproterenol(g/L)10－4g/L isoproterenol+propranolol(g/L)10－5 5×10－5 10－4 10－4 5×10－4 10－3 Cardiac output(mL/min) 2.66±0.78 2.99±0.64＊＊ 3.43±0.37* 3.62±0.32* 3.04±0.48△△ 2.37±0.76△△ 1.89±0.79△△Maximum force(g) 1.91±0.25 1.95±0.32 1.98±0.33 2.13±0.42 1.70±0.19△△ 1.50±0.19△△ 1.38±0.16△△Minimum force(g) 0.98±0.03 0.93±0.04＊＊ 0.81±0.05＊＊ 0.78±0.07＊＊ 0.76±0.05 0.78±0.06 0.79±0.07 Force range(g) 0.93±0.26 1.01±0.34 1.17±0.35 1.35±0.43＊＊ 0.94±0.19△△ 0.72±0.19△△ 0.59±0.17△△PR interval(ms) 323.33±54.49 305.00±57.28 ＊＊ 284.44±41.64＊＊ 283.89±48.98＊＊ 300.56±49.90 346.67±59.63△△ 371.11±59.57△△QRS width(ms) 160.00±14.58 168.33±27.39 162.78±18.73 174.44±21.42 175.00±22.91 186.11±20.43 202.22±18.05△△QT interval(ms) 772.22±205.97 793.89±193.71 991.11±210.64* 1082.78±220.77＊＊ 927.33±232.16△ 771.67±186.21△△ 744.44±144.86△△R wave amplitude(mV) 0.056±0.024 0.063±0.032 0.061±0.023 0.073±0.028* 0.061±0.025△ 0.046±0.015△△ 0.037±0.015△△R and S wave amplitude(mV) 0.089±0.038 0.103±0.054 0.144±0.155 0.114±0.036* 0.099±0.039△ 0.082±0.025△△ 0.076±0.023△△Heart rate(min－1) 30.20±6.79 30.98±6.24 28.91±5.69 30.16±6.56 30.76±6.25 27.30±4.32 24.72±3.70△

2 異丙腎上腺素對離體原位心臟活動和心電圖的影響

離體原位心臟灌流模型中，異丙腎上腺素對心臟活動和心電圖的影響見圖3、表1。與給藥前相比較，在10－5～10－4g/L濃度范圍內，隨著異丙腎上腺素濃度的增加，心輸出量逐漸增多(P＜0.05，P＜0.01)，最大張力逐漸增大，最小張力逐漸變小(P＜0.01)，心肌舒縮幅度逐漸變大(10－4g/L時，P＜0.05)。在心電圖中表現為，心率無顯著變化，但PR間期逐漸縮短(P＜0.01)，QT間期逐漸延長(P＜0.05，P＜0.01)，R波和 R+S波電壓逐漸增大(10－4g/L時，P＜0.05)。

3 普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響

離體原位心臟灌流模型中，普萘洛爾對異丙腎上腺素作用的影響見表1、圖4。與10－4g/L異丙腎上腺素作用相比較，在10－4～10－3g/L濃度范圍內，隨著普萘洛爾濃度的增加，心輸出量逐漸減少(P＜0.01)，最大張力逐漸變小(P＜0.01)，最小張力無明顯變化，心肌舒縮幅度明顯變小(P＜0.01)。在心電圖中表現為，心率逐漸變慢(10－3g/L時，P＜0.05)，PR間期逐漸延長(P＜0.01)，QRS波群時間逐漸延長(10－3g/L時，P＜0.01)，QT間期逐漸變小(P＜0.05，P＜0.01)，R波和R+S波電壓逐漸變小(P＜0.05，P＜0.01)。

Figure 3.Effects of isoproterenol on the cardiac force and ECG of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10－5g/L isoproterenol;b:perfused with 5 ×10－5g/L isoproterenol;c:perfuse with 10 －4g/L isoproterenol.圖3 異丙腎上腺素對蟾蜍離體原位自發性搏動心臟張力和心電圖曲線的影響

Figure 4.Effects of propranolol on isoproterenol(10－4g/L)－induced cardiac activities of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10 －4g/L isoproterenol and 10 －4g/L propranolol mixture;b:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 5 ×10－4g/L propranolol mixture;c:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 10 －3g/L propranolol mixture.圖4 普萘洛爾對異丙腎上腺素所致的蟾蜍離體原位自發性搏動心臟活動的影響

討 論

本實驗利用蟾蜍離體原位自發性搏動心臟模型同步監測了灌注正常生理鹽溶液條件下的心輸出量、心肌舒縮張力和心電圖。如圖2所示，通過心臟搏動張力曲線能夠記錄到心臟節律性舒縮程度、幅度和節律，標準肢體II導聯心電圖波形曲線可記錄到P波、QRS波群的幅度和時間、PR間期和QT間期等;2種曲線同時監測，利于分析二者間的相關性。該實驗結果與宋士軍等［4］的實驗結果一致，能夠觀測到心房和心室的搏動波，且P波和QRS波群早于心房收縮波和心室收縮波。實驗發現，流入管和流出管管徑大小對實驗結果有較大的影響;管道過細導致液體循環受阻，影響心臟功能，過粗不利于插管，易導致手術失敗。經參照McKean等［5］的方法和反復實驗，流出管和流入管均用了外徑2 mm和內徑1.5 mm的硅膠管。通過實驗發現，體重在50～70 g之間的蟾蜍心臟耐受性較好。40 g以下或100 g以上易出現心臟增大變形、心率減慢、心律不齊，甚至出現房室瓣關閉不全導致液體逆流等現象。心電圖是從體表記錄到的心臟在每一心動周期所產生的電活動變化曲線圖形。由體表所采集到的心電位強度，與探查電極的方位和心肌除極或復極方向所構成的角度有關;夾角愈大，心電位在某導聯軸上的投影愈小，電位愈弱。心尖和探查電極的位置相對固定，利于得到相對穩定的心電圖波形。由于受各種因素的影響，暴露的蟾蜍心尖所處的位置并不完全一致。為使得到的心電圖相對穩定，易于記錄各波的幅值，在本實驗過程中要求:(1)蛙心夾的系線應盡量水平牽拉，使心臟不離開胸腔;(2)將系線拉向蟾蜍的左后肢方向，并用結扎左右腔靜脈等的結扎線拉向與之反向的蟾蜍頭部右上方。這樣得到的心電圖中各種波形明顯，QRS波群的主波方向向上，利于監測各個波形振幅和間期;同時，可以防止左右主動脈因受牽拉變形導致灌流液流出受阻。

通過灌注β受體激動藥異丙腎上腺素和其拮抗藥普萘洛爾發現，該實驗模型能夠較好地顯示異丙腎上腺素的正性肌力作用和普萘洛爾的拮抗作用。在灌注異丙腎上腺素時，隨著其濃度的增加，心輸出量逐漸增多，收縮張力逐漸增大，舒張張力逐漸變小，舒縮幅度逐漸變大，顯示了異丙腎上腺素不僅使心肌收縮力增強，同時使舒張程度增加的作用。在心電圖中表現為PR間期逐漸縮短，QT間期逐漸延長，QRS波群時間無明顯變化，即房室傳導加快，心臟的舒張期相對延長，進一步證實了異丙腎上腺素能夠使心室舒張程度增加。與鄭廣華等［6］的實驗結果相似，異丙腎上腺素對一些蟾蜍心臟具有正性頻率作用，而對其它蟾蜍心臟無正性頻率作用，統計結果未顯示正性頻率作用。在灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾混合溶液時，隨著普萘洛爾濃度的增加，心輸出量逐漸減少，收縮程度逐漸減小，心肌舒縮幅度明顯變小，顯示出其對異丙腎上腺素的拮抗作用。心電圖中表現為心率逐漸變慢，PR間期逐漸延長，QRS波群時間逐漸延長，QT間期逐漸變小，進一步證實了其拮抗作用。

通過灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾發現有趣的一點:用異丙腎上腺素置換任氏液后，隨著異丙腎上腺素濃度的增加，R波和R+S波電壓逐漸變大;而在灌注異丙腎上腺素和普萘洛爾混合溶液時，R波和R+S波電壓逐漸變小。這種現象與心臟機械性收縮過程中的舒縮幅度的變化趨勢相似，見圖3、4。心電圖是通過放置在體表的電極記錄到心臟電活動圖形，而心臟收縮由心肌細胞電活動所引發。在一定的初長度下，工作細胞可通過增加粗肌絲上活化的橫橋數目來增強心肌收縮力?；罨臋M橋在全部橫橋中所占的比例決定于興奮時胞質內Ca2+的濃度和(或)肌鈣蛋白對Ca2+的親和力。兩棲類的心肌細胞肌質網很不發達［7］，ryanodine受體幾乎難以找到［8］，心肌收縮主要依賴細胞外鈣內流。異丙腎上腺素可通過cAMP轉導途徑，激活細胞膜上的L型鈣通道，增加Ca2+內流，使心肌收縮力增強。本實驗中蟾蜍心尖拉向左后肢標準肢體Ⅱ導聯的正極方向，而異丙腎上腺素能夠使心臟舒張程度增大，導致心室在舒張期與心電圖正極之間的距離變小。由于心電圖QRS波群振幅大小與正電極和心室間距離的平方成反比［9］，異丙腎上腺素引起的心室與正極之間的距離變小可能引起QRS振幅變大。具體原因有待進一步證實。

由于本實驗方法能夠用簡單的設備和材料同時監測心臟機械性活動和電活動過程，具有簡單、有效而且經濟等優點，對于心臟的生理、病理生理和藥理學研究，以及醫學生在機能實驗學的綜合性、設計性和探索性實驗研究等有一定的參考價值。

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