維生素E對先天性膈疝大鼠模型胎仔肺發育及肺血管重構的影響

林 涵，王鑾虹，劉文英，王學軍，吉 毅，楊 綱

(1.汕頭大學醫學院第一附屬醫院小兒外科，廣東 汕頭 515041;2.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院婦瘤科，廣東 汕頭 515031;3.四川省醫學科學院·四川省人民醫院兒童醫學中心，四川 成都 610072)

經過多年的努力，先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)患兒的病死率仍然高達50%，其死亡的主要原因是肺發育不成熟(pulmonary hypoplasia，PH)和持續性肺血管高壓(persistent pulmonary hypertension，PPH)。如何通過產前干預或者預防的方法，促進患兒的肺發育和改善其肺血管重構是提高該病存活率的關鍵。

1 材料與方法

1.1 模型建立與動物分組 汕頭大學醫學院動物實驗中心提供的成年健康SD雌鼠20只，平均體重(248±11.5)g和6 只雄鼠平均體重(279±3.2)g ，2∶1夜間進行交配，次晨取陰道內容物涂片，以鏡下檢測到精子確定為妊娠，并以當日為妊娠第0.5 d計算妊娠時間，交配后共18只大鼠懷孕。孕9.5 d采用成組設計將孕鼠用簡單隨機法分為3組:對照組、膈疝組和干預組(各6只)。膈疝組和干預組給予除草醚(浙江化工二廠)125 mg/只(溶于2 ml橄欖油)灌胃;對照組給予等量橄欖油。至孕11.5 d，干預組在孕11 d給予維生素E(美國Sigma公司)140 mg/kg(溶于2 ml酒精)灌胃(1次/天，連續3天)，在維生素E服用過程中采用避光措施。膈疝組和干預組給予等量酒精。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及膈疝觀察 雌鼠孕21 d在戊巴比妥(0.03 mg/g)麻醉下剖宮取出胎鼠，在電子分析天平上稱重量記錄體重后處死，經胸骨正中切口剖胸，取出兩側肺組織在電子天平上稱重后在放大鏡(4倍)下觀察有無膈肌缺損，記錄胎鼠膈疝的位置、疝孔大小和疝內容物。計算胎鼠肺重與體重之比(Lw/Bw)。

1.2.2 光鏡標本制定及觀察 取出胎肺用10%甲醛溶液固定，48 h后常規石蠟包埋，切片后行HE及彈力纖維染色，進行組織學觀察(Nikon E600圖像分析顯微鏡)。

1.2.3 組織學切片圖像分析 應用spot V3.0圖像采集軟件和image-pro plus V4.10專業圖像分析軟件測定每個視野肺組織灰度值百分比［1］，反映肺泡與肺泡腔面積的百分比-肺泡面積比(PAA%)、肺泡間隔面積比(ASA%)及軸向腺泡計數(axial acinar count，RAC)。分別計算每個切片單位面積內腺泡前動脈(PAPA)和腺泡內動脈(intra-acine pulmonary arteries，IAPA)總數，分別測量計算其平均血管外徑(ED)及平均中膜厚度百分比(MT%)。并計算肌型動脈(MA)、部分肌型動脈(PMA)、非肌型動脈(NMA)的數目及其所占的百分比。以上測定均用雙盲法由同一操作者在×400倍光鏡下完成。在取標本時，以相應光鏡檢測表明取材較理想者各組取3個標本作電鏡檢測，擬作電鏡觀察的肺標本用3.0%戊二醛固定48 h后備檢。電鏡觀察使用日立H-600IV型透射電子顯微鏡觀察及照相。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。實驗數據以均數±標準差表示，數據經方差齊性檢驗后，膈疝組和干預組致畸率的比較采用四格表資料率的比較的χ2檢驗。對各實驗組的肺重/體重應用成組設計的秩和檢驗(方差不齊)進行統計學分析，并以Nemenyi法進行兩兩比較。其余指標參數檢驗方差齊性之后，采用成組設計的多個樣本均數比較的單因素方差分析進行統計學比較，組間兩兩比較采用LSD檢驗法。各組間比較采用Student-Newman-Keuls法進行檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 對照組獲得胎仔42只，無膈疝形成。膈疝組獲得胎仔39只，有膈疝形成者26只，致畸率66.67%。干預組產胎仔41只，有膈疝形成者19只，致畸率46.34%。膈疝組和干預組的致畸率差異有統計學意義(P＜0.05)。膈肌缺損多位于左側，疝內容物主要為小腸、胃和肝臟。

2.2 光鏡觀察

2.2.1 Lw/Bw和肺發育的形態學指標 Lw/Bw、軸向腺泡計數(RAC)、肺泡面積比例(Alveoli%)、肺泡面積比(PAA%)及肺泡間隔面積比(ASA%)等體現肺發育不良的形態學指標測定結果表明，維生素E能有效地改善肺組織發育，并增加肺重量/體重比值(mg/g)，與膈疝組相比差異有統計學意義，見表1。

表1 各組Lw/Bw(mg/g)和肺實質發育的形態學指標比較

2.2.2 HE染色肺形態觀察 對照組肺泡結構明顯，腺泡大，肺泡間質薄而均勻，呼吸性支氣管末端呈囊泡狀，肺小血管管壁菲薄，管腔大，中膜平滑肌細胞呈梭形，肌層肺組織發育成熟或接近成熟，整體外觀呈肺泡期的肺形態。膈疝組肺泡小而少，間質厚，支氣管末端囊泡狀結構少見，肺小血管管壁明顯增厚，血管腔狹窄，中膜平滑肌細胞增生，肌層肥厚，肺組織發育停滯于假腺體期。干預組均肺泡增大，肺泡間質變薄，肺小血管壁變薄，血管腔變大，介于兩者之間，肺組織發育處于腺泡早期。

2.2.3 肺血管的改變 MT%的變化:膈疝組的MT%與對照組比較明顯升高，其差異有統計學意義。維生素E可使除草醚引起膈疝的胎鼠之IAPA(肺腺泡內動脈)的MT%(中膜厚度)降低，差異有明顯的統計學意義，見表2、圖1。

表2 各組胎肺間質血管形態指標比較 (%)

2.3 電鏡觀察 與對照組相比，膈疝組的IAPA的內皮細胞變性肥大，平滑肌增生和膠原纖維顯著增加;干預組的IAPA的內皮細胞輕度變性，平滑肌輕度增生，成纖維細胞增生明顯，膠原纖維增加，見圖2。

圖1 肺腺泡內動脈MT%的變化 a:對照組，b:膈疝組，c:干預組;圖2 胎鼠肺組織切片電鏡觀察EM×12000 a:對照組，b:膈疝組，c:干預組

3 討論

目前CDH尚缺乏有效的病因治療，CDH患兒死亡率高的主要原因是PH和PH［1，2］。PH和PPH在胚胎期已經發生，生后繼續發育改善的能力有限，各種生后治療手段也不能很好地改善肺發育不成熟和肺血管高壓，因此目前研究的熱點之一聚焦在如何通過產前用藥改善胎肺發育上。糖皮質激素已被應用于PH的產前治療，但其可干擾母體的內分泌系統并可能導致流產。故探索其他可能產前改善肺發育和肺血管重構的藥物對CDH的治療有重大意義。

維生素E是最主要的抗氧化劑之一，可保護其他易被氧化的物質，減少過氧化脂質的生成，保護機體細胞免受自由基的毒害，抑制脂質過氧化及形成自由基。機體在正常代謝過程中產生一定量的自由基，同時機體內存在著抗氧化作用的自由基清除劑如維生素E、C和硒等，正常情況下，兩者呈動態平衡。當自由基產生過多或者抗氧化劑不足，此平衡系統失衡，都會導致機體發生疾病。如果自由基沒有及時被抗氧化劑清除，就會與距其最近的脂肪、蛋白、碳水化合物RNA或者DNA等產生反應，改變它們的結構和功能［3］，導致機體產生疾病。維生素E能維持生物膜完整性和穩定性，有抗炎和增強免疫作用，能保護體內易被氧化的物質，提高紅細胞膜、溶酶體膜的穩定性，維持和促進免疫細胞的正常功能，目前已被大量應用于治療動脈粥樣硬化和缺血性心臟?。?～6］。本實驗采用維生素E對大鼠CDH模型進行產前干預并觀察其療效。

本實驗采用除草醚誘導先天性膈疝大鼠模型，致畸率達50.70%，HE染色發現正常對照組外觀呈肺泡期的肺形態，而膈疝組肺組織發育停滯于假腺體期，肺泡小而且數量少，肺泡間隔厚，肺實質呈假腺體樣改變。干預組的肺組織發育處于腺泡早期。體現肺發育成熟的指標表明膈疝組肺發育不良，干預組的肺發育程度明顯改善，表明維生素E能有效地改善肺發育不良。

IAPA系呼吸性細支氣管至肺泡隔毛細血管前這一段肺動脈的總稱，它包括MA、PMA、NMA三種不同的血管段，泡內肺動脈對血液灌注和阻力具有很大的緩沖能力，是控制肺動脈血流動力學的關鍵血管。近年來，有關肺腺泡內動脈構形重建與肺動脈高壓形成之間的關系日益受到重視［7］。人類和大鼠膈疝肺血管高壓的病理基礎主要是肺血管橫斷面積減少，血管內側壁增厚和腺泡內動脈異常肌化［8～10］。本實驗中，膈疝組胎鼠 IAPA的 MT與對照組比較明顯增厚，表明其血管內側壁增厚和腺泡內動脈異常肌化。而在干預組中，肺腺泡內動脈的MT明顯下降。維生素E可能主要通過抑制肺小動脈特別是IAPA的肌化減輕肺動脈高壓。

本實驗表明維生素E能改善先天性膈疝的肺發育不良及肺血管重構，目前其作用的機制尚不清楚，可能與其清除自由基的作用有關。目前臨床上維生素E在推薦劑量下還未發現有明確的副作用，而維生素E在本實驗的使用過程中，未發現服用的孕鼠有明確的不適癥狀。故在不影響效果的條件下，產前使用維生素E也許可以作為將來治療先天性膈疝肺發育不良及肺血管重構的一種選擇。

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