抑癌基因WWOX與相關基因p73、Bax在結直腸癌中的表達及意義

陳志英，何 常，李 佽，劉 莉，劉都禮

(1.成都大學附屬醫院病理科，四川 成都 610081;2.貴陽醫學院病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一。在我國，隨著生活水平提高，飲食習慣改變，結直腸癌的總體發病率也呈上升趨勢。大量研究表明，結直腸癌的發生發展是由多因素引起，多基因參與并經歷了多階段的演變過程。本研究應用免疫組化法對結直腸癌中含有WW結構域的氧化還原酶基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)、p73 及Bax的表達進行研究，探討它們在結直腸癌發生發展中的作用及其相互關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集貴陽醫學院病理科1994～1998年結直腸癌手術切除標本共計348份，選取其中臨床及隨訪資料完整并且術前均未經化療和放療的同一組織學類型及治療方法相同病例的58份標本;同時收集同期結直腸黏膜炎癥標本20份作對照。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 試劑及方法 濃縮型兔抗人多克隆抗體WWOX為英國Abcom公司產品，工作濃度為1∶300;濃縮型鼠抗人單克隆抗體Bax為北京中杉生物技術有限公司產品，工作濃度為1∶300;濃縮型兔抗人多克隆抗體p73為武漢博士德生物工程有限公司產品，工作濃度為1∶100;Envision二步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購于北京中杉生物技術有限公司。所有染色均進行高溫高壓抗原修復。

1.3 結果判定 主要以細胞漿染色有清晰淡黃色至棕黃色顆粒為陽性，胞核偶見著色。每張切片于顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，計算陽性細胞數占細胞總數的均值(不足10個視野的，以可以觀察到的最多高倍視野計算)。陽性結果判定根據以下兩方面的總分進行判斷:①選染色均勻的陽性表達腫瘤區域，以陽性細胞所占百分比分五級計分:陽性細胞率＜5%計0分;陽性細胞率5% ～25%計1分;陽性細胞率26% ～50%計2分;陽性細胞率51% ～75%計3分;陽性細胞率＞75%計4分。②按染色強度來分:不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～7分為陽性(+)。以上方法均由兩名病理醫師采用雙盲法獨立檢測，取平均值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 11.5軟件包進行分析，癌組織與炎癥對照組織間蛋白表達的比較及癌組織中WWOX蛋白表達與臨床病理特征的關系用χ2檢驗，蛋白間相關性用χ2關聯性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WWOX、p73、Bax在不同結直腸組織中的表達 表1顯示，WWOX在結直腸癌中的表達明顯低于炎癥組織，兩組比較差異具有統計學意義(χ2=9.900，P＜0.01);Bax在結直腸癌中的表達明顯低于炎癥組織，兩組比較差異具有統計學意義(χ2=4.572，P＜0.05);p73在結直腸癌中的表達明顯高于炎癥組，兩組比較差異有統計學意義(χ2=6.866，P ＜0.01)。

表1 結直腸癌及結直腸黏膜炎癥中WWOX、p73及Bax的表達

2.2 WWOX、p73、Bax表達與結直腸癌臨床病理特征之間的關系 表2顯示，WWOX在結直腸癌中的表達與浸潤深度(χ2=6.169，P ＜ 0.05)及預后(χ2=9.893，P ＜ 0.01)密切相關，與年齡、性別及淋巴結轉移無關(P＞0.05)。p73在結直腸癌中的表達與淋巴結轉移(χ2=4.315，P ＜ 0.05)及浸潤深度(χ2=4.207，P ＜ 0.05)相關，而與患者的年齡、性別及預后無關(P＞0.05)。Bax在結直腸癌中的表達與患者的預后相關(χ2=5.545，P ＜ 0.05)，與患者的年齡、性別、淋巴結轉移及浸潤深度無關(P＞0.05)。

表2 WWOX、p73及Bax的表達與結直腸癌臨床病理特征之間的關系

2.3 結直腸癌組織中WWOX與p73及Bax表達的相關性 WWOX陽性表達的15例結直腸癌組織中有10例p73表達陽性，13例Bax表達陽性，χ2關聯性分析表明WWOX與p73的表達無相關性(P＞0.05)，與Bax的表達呈正相關(P＜0.05)，見表3。

表3 結直腸癌組織中WWOX與p73、Bax表達的相關性

3 討論

WWOX基因是Bednarek等［1］在2000年應用鳥槍基因測序技術結合對感興趣區域對應的轉錄子進行分離并分析的方法鑒定得到的一個新的包含有FRA16D的基因，跨越了基因組內一個大于100萬bp的區域，這個區域位于染色體的16q23.3～q24.1(普通型脆性位點，FRA16D)。

目前人們通過研究已經在肺小細胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗狀上皮細胞癌等多種腫瘤中發現了WWOX的表達異常，推測WWOX基因為新的腫瘤相關基因［1～6］。本研究我們應用免疫組化方法檢測了結直腸癌組織及結直腸黏膜炎癥組織中WWOX蛋白的表達，結果顯示WWOX在癌組織中的表達明顯低于炎癥組織，這與其他相關報道一致，提示WWOX蛋白的低表達可能在結直腸癌的發生發展中起了重要作用。另外，試驗中我們發現WWOX在結直腸癌中的表達與腫瘤的浸潤深度及患者的預后密切相關(P＜0.05，P＜0.01)。目前WWOX蛋白在人腫瘤中的詳細作用機制還不清楚，但有研究表明在鼠的體內與WWOX基因功能及結構類似的基因(WOX1)已被證實是腫瘤壞死因子(TNF-α)介導的細胞凋亡過程中必不可少的中介物。WOX1位于細胞的線粒體內，TNF通過誘導線粒體膜通透性的改變導致WOX1從線粒體釋放，促進細胞的凋亡。根據人和鼠間的高度同源性，我們分析當WWOX蛋白低表達甚至失活時，影響了TNF的作用過程，從而降低或喪失對細胞凋亡的控制，導致腫瘤的發生。

作為p53家族的成員之一，p73蛋白與P53蛋白在序列上具有同源性，也能夠誘導細胞周期阻滯和凋亡。Jost等［7］將野生型p73轉染SAOS2細胞后發現，細胞發生了明顯的凋亡，而轉染p73突變體的細胞株卻沒有這種現象。因此人們推測p73是一抑癌基因。然而最近的研究發現，p73在很多腫瘤組織中高表達，在相應的正常組織中低表達。Kang等［8］研究表明，在正常胃組織和4/5的研究細胞系中p73極低水平表達，但37/39的癌組織中p73明顯升高。另外人們在肝細胞癌、肺癌等也檢測到高水平表達的p73，但對其高水平表達的機制及其是否為抑癌基因仍不是很清楚。本次試驗結果顯示p73在結直腸癌組織中過度表達，顯著高于炎癥組，且與浸潤深度成正相關(P＜0.05);在有淋巴結轉移組p73陽性表達率也明顯高于無淋巴結轉移組(P＜0.05)。我們認為，p73在結直腸癌中的過度表達與結直腸癌的發生發展密切相關，p73可作為結直腸癌淋巴結轉移的一個重要指征。

Bax是Bcl-2家族中最重要的促凋亡蛋白，Bcl-2家族在細胞凋亡的調控中扮演了重要的角色。Sarbia等［9］對食管癌的研究顯示Bax在食管癌的表達明顯低于正常食管上皮，并且隨著腫瘤分化程度的下降而減低。Marx等［10］檢測了215例卵巢癌的Bax表達情況，發現Bax的陽性率為47%，明顯低于正常組織。我們的結果和其他報道一致，同時我們發現Bax的表達與預后關系密切，高表達預示患者的預后好，生存期長。我們推測Bax基因的檢測對于結直腸癌的預后診斷有一定的參考意義。

WWOX基因由9個外顯子構成，其ORF長度為1245bp，編碼一個長414個氨基酸，46kDa的蛋白［11］。研究發現WWOX蛋白可同多種蛋白相互作用。Aqeilan等［12］就報道了人的 WWOX可直接在胞漿中通過第一WW結構域與p73的482PPPP Y488基序互相作用，形成結合復合物產生促凋亡作用。本次試驗顯示WWOX與p73的表達無相關性(P＞0.05)。國外學者通過研究發現WWOX與p73共同轉染時可增強細胞凋亡，單獨轉染也能引起細胞凋亡，由此推測在人體內應該存在一條獨立于p73的關于WWOX促細胞凋亡的途徑，在結直腸癌中WWOX可能主要通過該途徑來發揮其對腫瘤細胞的促凋亡作用，因此在結直腸癌組織中兩者未體現出相關性。

另外，有文獻報道WWOX蛋白主要位于線粒體，WWOX通過下調凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xl及上調P53的表達增強TNF的細胞毒性功能，而TNF通過促使線粒體通透性的改變而導致WWOX從線粒體釋放入核內，起促凋亡的作用。Bax是Bcl-2家族中最重要的促進凋亡蛋白，此次研究發現WWOX與 Bax有協同作用(χ2=6.561，P ＜ 0.05)，我們推測WWOX可能通過上調Bax的表達等一系列相同的作用方式促進細胞的凋亡。因此聯合檢測兩者在結直腸癌中的表達可能對其預后的診斷有著重要的作用。

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