HPLC法測定人血漿中吉非替尼的濃度

李 翔，劉皈陽，王明媚，王 芳，李 雷（解放軍總醫院第一附屬醫院藥劑藥理科，北京 100037）

吉非替尼是第一個用于肺癌治療的蛋白激酶抑制藥，在體內通過與三磷酸腺苷競爭與表皮生長因子受體結合，產生抗腫瘤活性作用，具有協同化療藥抗癌的效果，臨床主要用于治療局部晚期或轉移性非小細胞肺癌[1-2]。目前，吉非替尼在癌癥臨床治療中的應用日漸廣泛，建立相應的血藥濃度測定方法，進行治療藥物監測，可以為臨床合理用藥提供有益的借鑒和依據，降低不良反應的發生[3-4]。LC-MS/MS測定血漿中吉非替尼濃度的方法報道較多，具有專屬性強、靈敏度高等特點，但儀器設備價格昂貴，實驗成本較高[5-8]。此外，采用HPLC測定血漿吉非替尼濃度的方法也有報道，但其樣品預處理較為繁瑣，對精密度和準確度的影響較大[9]。本實驗擬使用操作較為簡便、成本低廉的乙腈蛋白沉淀樣品的預處理方法，減少血漿樣品用量，在保證檢測靈敏度的前提下，采用HPLC方法建立滿足靈敏度、精密度和準確度要求的吉非替尼血藥濃度測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括真空脫氣機，四元泵，自動進樣器，紫外檢測器）；METTLER AE200型電子分析天平（瑞士梅特勒）；80-2型離心沉淀器（金壇市金南儀器廠）；VORTEX-5型渦旋器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

吉非替尼對照品（南京安格醫藥化工有限公司，批號20111015）；內標：厄洛替尼（南京安格醫藥化工有限公司，批號 20111208）；空白血漿（北京市紅十字血液中心）；甲醇（色譜純，Burdick & Jackson）；乙腈（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；醋酸銨（分析純，北京化學試劑公司）；水為去離子水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨溶液（70∶30）；檢測波長：331 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：室溫；分析時間：12 min。

2.2 溶液的配制

精密稱取吉非替尼對照品44.69 mg，置25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.788 mg·mL-1儲備液，于4 ℃儲存。取儲備液，加乙腈稀釋，制成893.8 μg·mL-1工作液，同法配制715.0 μg·mL-1質量控制工作液。

精密稱取厄洛替尼對照品23.84 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得476.8 μg·mL-1內標儲備液，于4 ℃儲存。取內標儲備液，加乙腈稀釋，制成4.768 μg·mL-1內標工作液。

2.3 血漿樣品的預處理

將血漿樣品于37 ℃水浴解凍，精密吸取100 μL，置1.5 mL離心管中，加入4.768 μg·mL-1厄洛替尼溶液50 μL，混勻，再加入乙腈50 μL沉淀蛋白，混勻，4000 r·min-1離心10 min。取上層清液0.45 μm濾膜濾過，進樣。

2.4 標準曲線與質控用血漿的制備

將893.8 μg·mL-1吉非替尼工作液用空白血漿逐級稀釋，制成濃度為89.38，178.8，357.5，893.8，1788，3575，8938 ng·mL-1對照品系列血漿。同法，將715.0 μg·mL-1的質量控制工作液用空白血漿逐級稀釋制成143.0，715.0，7150 ng·mL-1的低、中、高3種指定濃度的質量控制樣品，考察方法學的各項指標。

3 結果

3.1 吉非替尼的色譜分離

按照“2.1”項和“2.3”項所述方法處理并測定，空白血漿、空白血漿加厄洛替尼、空白血漿加吉非替尼對照品及厄洛替尼的樣品色譜圖見圖1。由圖可見，在選定的色譜條件下，厄洛替尼與吉非替尼的保留時間分別為4.5 min和9.1 min。血漿中吉非替尼及厄洛替尼出峰處的本底及其他雜質的色譜峰對測定沒有任何干擾，具有良好的特異性和分離度。

3.2 線性關系考察

圖1 血漿樣品的HPLC色譜圖A-空白血漿；B-空白血漿加入厄洛替尼；C-空白血漿加入吉非替尼對照品和厄洛替尼；Ⅰ- 厄洛替尼（內標）；Ⅱ- 吉非替尼Fig 1 HPLC chromatograms of human plasma samplesA-blank plasma; B-blank plasma spiked with erlotinib; C-blank plasma spiked with gefitinib and erlotinib;Ⅰ- erlotinib (IS); Ⅱ-gefitinib

在89.38～8938 ng·mL-1濃度范圍內，血漿中吉非替尼濃度（Y）與吉非替尼峰面積及厄洛替尼峰面積的比值（X）具有良好的線性關系。在精密度與準確度實驗中制得的3條標準曲線，r＞ 0.999。第1天的標準曲線回歸方程為Y= 3 516.89X-7.95（r= 0.999 9）。

3.3 日內與日間精密度和準確度

取“2.4”項中配制的低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，按照“2.3”項和“2.1”項方法處理并測定，考察日內的準確度（RE）和精密度（RSD）（n= 5）；同法操作連續測定3 d，考察日間的RE和RSD（n= 3）。按照隨行的血漿標準曲線進行定量，計算吉非替尼的濃度，結果見表1。

3.4 定量下限

按“2.4”項下方法配制5份89.38 ng·mL-1的吉非替尼對照品血漿，按照“2.3”項和“2.1”項方法處理并測定。由隨行處理的血漿標準曲線進行定量，計算RE和RSD。結果信噪比＞ 5，表明本法的信噪比良好。最低定量濃度的RE（n= 5）為- 1.81%，RSD（n=5）為3.09%，完全滿足此濃度下定量分析的要求。

表1 人血漿中吉非替尼的RE與RSDTab 1 REs and RSDs of gefitinib in human plasma samples

3.5 提取回收率

取“2.4”項中配制的低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，按“2.3”項和“2.1”項方法處理并測定其中吉非替尼的峰面積。另外，取吉非替尼工作液，加乙腈逐級稀釋，制成相應濃度的吉非替尼溶液，按“2.1”項方法測定吉非替尼的峰面積。將上述低、中、高3種濃度溶液的對應峰面積值進行比較，計算吉非替尼的提取回收率。血漿中吉非替尼在低、中、高3種濃度的提取回收率（n= 5），結果見表2。

表2 人血漿中吉非替尼的回收率.n = 5Tab 2 Recovery of gefitinib in human plasma samples.n = 5

3.6 樣品穩定性

3.6.1 凍融穩定性 取低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，經過3次反復凍融（- 20～37 ℃）處理后測定吉非替尼的峰面積。利用未經凍融處理，新建立的標準曲線計算濃度，結果測定值與理論值的偏差為- 13.60% ～-10.30%（n= 5）。

3.6.2 低溫放置穩定性 取低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，處理后在低溫（4 ℃）冷藏放置24 h后進樣測定吉非替尼的峰面積。利用新建立的標準曲線計算濃度，結果測定值與理論值的偏差為- 7.21% ～- 0.75%（n= 5）。

3.6.3 室溫放置穩定性 取低、中、高3種濃度的質控樣品各5份，在室溫下（25 ℃）放置24 h后，進行處理、進樣測定吉非替尼的峰面積。利用新建立的標準曲線計算濃度，結果測定值與理論值的偏差為- 12.96% ～-8.97%（n= 5）。

結果顯示，在反復凍融3次、低溫冷藏、室溫放置等3種儲存條件下，樣品的測定值與理論值的偏差均符合要求，表明樣品在這些條件下的穩定性良好。

4 討論

在確定色譜條件的過程中，我們對流動相的組成和比例進行了系統優化。嘗試采用甲醇-水或乙腈-水作為流動相，均無法避免吉非替尼色譜峰的拖尾現象。另外，在流動相中增加冰醋酸的含量，通過改變流動相的pH值對改善色譜峰的拖尾現象仍不理想。最后，采用甲醇-醋酸銨作為流動相體系，可以取得滿意的色譜峰形及合適的分離效果。此外，通過比較1，10，20 mmol·L-1等不同濃度醋酸銨對分離的影響，確定甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨為最優的流動相體系。

在血漿樣品預處理的優化過程中，比較甲醇和乙腈的血漿蛋白沉淀效果。在加入相同體積沉淀試劑的情況下，乙腈的處理效果明顯好于甲醇，同時可以保證較高的檢測靈敏度，滿足人血漿中低濃度吉非替尼的測定。此外，使用乙腈直接沉淀蛋白法處理樣品，簡便快捷，成本低廉，能夠滿足分析要求，與其他方法相比，便于操作，易于推廣，可滿足大批量樣品測定的要求。

[1] 徐朝江，王卓，姚遠兵.吉非替尼治療肺癌的研究進展[J].醫藥導報，2007，26（3）：254-257.

[2] 王春敏，李煒，仇綴百.靶向抗腫瘤藥物吉非替尼的臨床研究進展[J].中國臨床藥學雜志，2007，16（2）：127-130.

[3] 謝吉科，姜德春.治療藥物監測的研究進展[J].中國藥物應用與監測，2011，8（6）：379-382.

[4] 朱曼，郭代紅，劉皈陽，等.臨床藥師對我院呼吸科藥品不良反應監測和處置的影響[J].中國藥物應用與監測，2009，6（3）：178-180.

[5] Zhao M, Hartke C, Jimeno A,et al.Specific method for determination of gefitinib in human plasma, mouse plasma and tissues using high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2005, 819(1): 73-80.

[6] Honeywell R, Yarzadah K, Giovannetti E,et al.Simple and selective method for the determination of various tyrosine kinase inhibitors used in the clinical setting by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2010, 878(15-16): 1059-1068.

[7] Wang LZ, Lim MY, Chin TM,et al.Rapid determination of gefitinib and its main metabolite, O-desmethyl gefitinib in human plasma using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2011, 879(22): 2155-2161.

[8] Chahbouni A, den Burger JC, Vos RM,et al.Simultaneous quantification of erlotinib, gefitinib, and imatinib in human plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Ther Drug Monit, 2009, 31(6): 683-687.

[9] Faivre L, Gomo C, Mir O,et al.A simple HPLC-UV method for the simultaneous quantification of gefitinib and erlotinib in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011, 879(23): 2345-2350.