TAT-tCNTF提高Aβ損傷細胞模型的GSH水平和SOD酶活性研究

吳行偉，張 琴，唐 希，吳 坤，任文靜，趙振滿，陳曉倩，金 欣，王德花，劉澤源，曲恒燕（.軍事醫學科學院附屬醫院藥學部，北京 0007；.軍事醫學科學院附屬醫院檢驗科，北京 0007）

阿爾茨海默病（alzheimer disease, AD）為中樞神經系統退行性疾病，β淀粉樣蛋白（amyloid beta, Aβ）異常聚集和老年斑的形成被認為是AD發病的主要機制[1]。目前治療AD的藥物多是針對其引起的外在癥狀，缺乏能從根本上抑制Aβ聚集，阻止老年斑形成，促進神經元存活的藥物。睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）能促使多種神經細胞的存活，是第一個被發現的能維持在體和離體脊髓運動神經元的存活及突起生長的營養因子[2-5]。CNTF能有效對抗Aβ的毒性并能抑制老年斑的形成，對AD的治療具有積極作用，但由于其分子量大，水溶性差，難以透過血腦屏障，故難以發揮對AD疾病的治療作用。人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的反義激活轉錄蛋白（transactivator transcription, TAT）中的TAT48-58是由11個氨基酸組成的蛋白轉導域，能攜帶生物大分子透過生物膜和血腦屏障而不改變其生物活性[6]。我們的前期研究[4,7]將截短式的tCNTF與TAT連接在一起得到TAT-tCNTF融合蛋白，并證明了其既能有效透過生物膜和血腦屏障，又能發揮對AD疾病模型的治療作用。

由Aβ誘導的腦組織及神經細胞的氧化應激效應對AD的發生和發展具有重要作用[8-11]，Aβ25-35是Aβ肽產生神經毒性的重要活性片段[12-13]，故本實驗采用體外Aβ25-35損傷人骨髓神經母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞模擬體內AD模型。有報道稱HIV-1-TAT蛋白能誘導細胞的氧化應激，誘導內皮細胞衰老和凋亡[14-15]。本課題組所研究的TAT-tCNTF融合蛋白中的TAT部分來源自HIV-1-TAT蛋白，可能具有增加模型內細胞和組織氧化應激程度的效應，從而加重AD疾病的程度。故此，我們選擇重組人睫狀神經營養因子（rhCNTF）和TAT-tCNTF中包含的蛋白轉導肽部分TAT48-58以及我們自行表達的TAT-tCNTF，采用析因設計和單因素多水平設計方法設計實驗，研究上述不同蛋白和Aβ損傷與否，以及不同濃度的TAT48-58肽段對SH-SY5Y細胞中SOD酶活性和GSH水平變化，為深入研究TAT-tCNTF治療AD的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

神經母瘤細胞SH-SY5Y（軍事醫學科學院附屬醫院臨床藥理室），SOD檢測試劑盒（日本株式會社同仁化學研究所），GSH檢測試劑盒（美國R&D公司），rhCNTF、Aβ25-35（Sigma公司），RPMI1640培養液（GIBCO公司），胎牛血清（北京四季青公司），TAT-tCNTF（本實驗室自行合成并驗證活性），TAT48-58肽段（上海波泰生物科技有限公司）。

1.2 TAT-tCNTF、TAT48-58和rhCNTF對Aβ損傷/非損傷模型的抗氧化效應

1.2.1 實驗設計 本實驗采用2×4析因設計，實驗因素為Aβ損傷與否和加入蛋白類型，Aβ損傷因素分為“損傷”和“不損傷”兩個水平，加入蛋白類型因素的水平分別為TAT-tCNTF、TAT48-58、rhCNTF和無蛋白對照組。故實驗分為8組：①損傷加TAT-tCNTF組；②損傷加TAT48-58組；③損傷加rhCNTF組；④損傷不加蛋白組；⑤無損傷加TAT-tCNTF組；⑥無損傷加TAT48-58組；⑦無損傷加rhCNTF組；⑧無損傷不加蛋白組。每組重復五次。

1.2.2 實驗方法 （1）Aβ模型的建立：將Aβ肽以無菌雙蒸水溶解配制成濃度為1 g·L-1的溶液，37 ℃下孵育1周以使其聚合。將聚合態的Aβ以10 μmol·L-1與SH-SY5Y細胞共同孵育24 h，即得損傷模型。

（2）實驗內容：收集SH-SY5Y細胞，以2×105個/孔鋪6孔板，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育2 h以使其貼壁。依實驗設計，向損傷模型細胞孔加入經37 ℃孵育1周（以使其聚合）后的Aβ使其終濃度為10 μmol·L-1。37 ℃孵育24 h，依實驗設計，向不同蛋白組中加入TAT-tCNTF、TAT48-58和rhCNTF，使TAT-tCNTF和rhCNTF的終濃度為250 μg·L-1，TAT48-58短肽以其分子量換算與TAT-tCNTF相同物質的量的終濃度為17.8 μg·L-1。37 ℃孵育24 h。消化收集細胞，反復凍融細胞5次以使其完全破碎，離心后取上清用SOD試劑盒檢測SOD的酶活性；用GSH試劑盒檢測GSH的含量。

1.3 TAT48-58肽段對SH-SY5Y細胞的氧化應激效應

1.3.1 實驗設計 本實驗采用單因素5水平設計，因素為TAT48-58肽的濃度，水平為0，178，356，890，1780 μg·L-1，每水平重復5次。

1.3.2 實驗方法 收集SH-SY5Y細胞，2×105個/孔鋪6孔板，37 ℃、5%CO2孵育3 h使其完全貼壁后加不同濃度TAT48-58，繼續孵育48 h。反復凍融5次使細胞破碎，離心取上清行GSH含量和SOD酶活性的檢測。

1.4 統計方法

結果采用（平均值±標準差）表示，析因設計結果采用析因設計定量資料的方差分析進行統計，兩兩比較采用LSMEANS方法實現；單因素多水平設計采用單因素多水平定量資料的假設檢驗。統計軟件采用SAS 9.1標準版。

2 結果

2.1 TAT-tCNTF對Aβ損傷模型的抗氧化效應

2.1.1 方差分析的總模型 SOD酶活性資料和GSH水平資料的方差分析模型統計量和P值分別是F=6.15，P= 0.000 1和F= 9.45，P= 0.000 1，說明模型均具有統計學意義，可用于資料的統計分析。本實驗的實驗結果如表1，TAT-tCNTF組和rhCNTF組分別與對照組比較的結果見圖1和圖2。

表1 加入不同的蛋白對SH-SY5Y細胞Aβ損傷/非損傷模型的SOD活性抑制率和GSH含量影響結果.n = 5,±sTab 1 Results of the inhibition ratio of SOD and concentration of GSH in SH-SY5Y cells damaged or undamaged by Aβ after being given different kinds of protein.n = 5,±s

表1 加入不同的蛋白對SH-SY5Y細胞Aβ損傷/非損傷模型的SOD活性抑制率和GSH含量影響結果.n = 5,±sTab 1 Results of the inhibition ratio of SOD and concentration of GSH in SH-SY5Y cells damaged or undamaged by Aβ after being given different kinds of protein.n = 5,±s

GSH濃度/U·L-1 TAT-tCNTF TAT rhCNTF 對照 TAT-tCNTF TAT rhCNTF 對照損傷 0.57±0.01 0.52±0.05 0.53±0.01 0.49±0.06 5283±578 4505±625 4992±150 4214±214非損傷 0.61±0.02 0.51±0.03 0.55±0.02 0.55±0.02 6394±173 5103±569 5722±125 5242±42損傷與否 SOD活性/%

圖1 TAT-tCNTF，rhCNTF對非Aβ損傷模型GSH水平和SOD酶活性的影響注：GSH水平數值為1/10 000 U·L-1；與RPMI1640培養基對照組相比， **P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05Fig 1 The GSH levels and SOD activity of Aβ undamaged model treated by TAT-tCNTF and rhCNTFNote: the GSH level value is 1/10 000 U·L-1; compared with the RPMI1640 control group, ** P ＜ 0.01, *P ＜ 0.05

圖2 TAT-tCNTF, rhCNTF對Aβ損傷模型GSH水平和SOD酶活性的影響注：GSH水平數值為1/10 000 U·L-1；與RPMI1640培養基對照組相比， **P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05Fig 2 The GSH levels and SOD activity of Aβ damaged model treated by TAT-tCNTF and rhCNTFNote: the GSH level value is 1/10 000 U·L-1; compared with the RPMI1640 control group, **P ＜ 0.01, *P ＜ 0.05

2.1.2 方差分析結果 損傷與否和蛋白類型對SHSY5Y細胞的SOD酶活性影響均有統計學意義，由酶活性的平均值0.53（損傷模型），0.56（未損傷模型）可知，損傷模型小于未損傷模型。四種蛋白類型的SOD活性率平均值為0.59（TAT-tCNTF），0.52（TAT48-58），0.54（rhCNTF），0.52（無蛋白對照），由此可知融合蛋白TAT-tCNTF和rhCNTF可明顯增高SH-SY5Y的SOD酶活性。TAT48-58與對照組相比SOD活性的差異無統計學意義。

損傷與否和蛋白類型對SH-SY5Y細胞的GSH含量影響均有統計學意義，由損傷因素平均值4749（損傷模型）小于5615（未損傷模型）可知，經Aβ損傷的SH-SY5Y細胞GSH水平明顯下降。蛋白因素GSH含量平均值為5839（TAT-tCNTF），4804（TAT48-58），5357（rhCNTF），4728（無蛋白對照），可知TAT-tCNTF和rhCNTF均可增加細胞內GSH含量。各因素的統計量見表2。

表2 各因素對GSH水平和SOD活性影響方差分析統計量Tab 2 Statistics values to the variance analysis of GSH level and SOD activity affected by different factors

2.1.3 SOD活性數據方差分析兩兩比較結果 損傷模型加TAT-tCNTF組與損傷對照組相比P＜ 0.001，說明TAT-tCNTF能顯著增加損傷模型的SOD酶活性；損傷模型加TAT-tCNTF組與損傷模型加rhCNTF組相比P＞ 0.05，說明TAT-tCNTF和rhCNTF對損傷模型SOD酶活性的影響無差異。無損傷加TAT-tCNTF組與無損傷無蛋白對照組相比P＜ 0.05，說明在Aβ無損傷的情況下，TAT-tCNTF也可以增加正常SH-SY5Y細胞的SOD酶活性。損傷模型加TAT48-58組與損傷模型無蛋白對照組相比P＞ 0.05，說明TAT對Aβ損傷模型SOD酶活性影響無統計學意義。無損傷加TAT48-58組與無損傷無蛋白對照組比較P＞ 0.05，說明在無損傷的情況下TAT48-58也不能改變SOD的酶活性。損傷模型加rhCNTF組與損傷模型對照組相比P＜ 0.05，說明rhCNTF能增加Aβ模型細胞的SOD酶活性；無損傷模型加rhCNTF組與無損傷模型組比較P＞ 0.05，說明rhCNTF不能顯著提高正常SH-SY5Y細胞的SOD酶活性。SOD活性數據兩兩比較結果見表3。

2.1.4 SOD活性數據方差分析兩兩比較結果 損傷加TAT-tCNTF組與損傷無蛋白對照組相比P＜ 0.01，說明TAT-tCNTF能增加Aβ損傷模型細胞的GSH含量；無損傷加TAT-tCNTF組與無損傷無蛋白對照組相比P＜ 0.01，說明在無損傷的情況下TAT-tCNTF也能提高細胞內的GSH水平。而TAT48-58蛋白組無論損傷與否，與相應無蛋白組相比P均大于0.05，說明TAT48-58無明顯增高細胞內GSH水平的效應。損傷模型加rhCNTF組與損傷無蛋白組相比P＜ 0.05，而無損傷加rhCNTF組與無損傷無蛋白對照組相比P＞ 0.05，說明rhCNTF在細胞無損傷的情況下不能顯著提高細胞內的GSH水平。GSH含量檢測水平間的兩兩比較結果見表4。

表3 不同蛋白對損傷/非損傷模型SOD水平影響實驗數據結果各水平組兩兩比較表Tab 3 The compared results of each level to the SOD level data of damaged/undamaged model treated by different protein concentrations

表4 不同蛋白對損傷/非損傷模型GSH水平影響實驗數據結果各水平組兩兩比較表Tab 4 The compared results of each level to the GSH level data of damaged/undamaged model treated by different protein concentrations

表5 加入不同TAT48-58濃度對SH-SY5Y細胞的SOD活性和GSH含量影響結果.n = 5,±sTab 5 Results to the activity ratio of SOD and concentration of GSH in SH-SY5Ycells after being treated by concentrations of TAT48-58.n = 5,±s

表5 加入不同TAT48-58濃度對SH-SY5Y細胞的SOD活性和GSH含量影響結果.n = 5,±sTab 5 Results to the activity ratio of SOD and concentration of GSH in SH-SY5Ycells after being treated by concentrations of TAT48-58.n = 5,±s

TAT48-58濃度/μg·L-1 SOD活性/% GSH水平/U·L-1 0 0.548±0.015 843±43 178 0.549±0.023 929±10 356 0.507±0.065 959±121 890 0.547±0.043 981±205 1780 0.499±0.040 1145±246

表6 不同濃度TAT48-58對SH-SY5Y細胞SOD活性和GSH水平影響的因素統計量Tab 6 Statistic values to the SOD activity and GSH level of SH-SY5Ycells treated by concentrations of TAT48-58

2.2 不同TAT48-58肽段濃度對SH-SY5Y細胞的GSH水平和SOD酶活性抑制率的影響

兩指標因素P值均大于0.05，故可認為不同濃度的TAT48-58對SH-SY5Y細胞的GSH水平和SOD酶活性無影響。SOD的酶抑制率和GSH水平見表5，單因素5水平設計因素統計量見表6。

3 討論

Aβ的聚集產生的致AD效應是目前接受最廣泛的發病原因之一，大量文獻顯示AD的發病與氧自由基的存在和由其產生的氧化應激效應也是密不可分的[16-17]，并且Aβ的聚集和氧化應激效應有著相互誘導相互促進的關系[18-19]。化合物的自由基清除能力和抗氧化應激能力也是衡量其緩解聚集態Aβ模型損傷程度和AD疾病效應的重要指示標準。GSH和SOD均是體內氧自由基有效的清除劑，GSH水平和SOD酶活性與體內氧自由基和氧化應激水平關系密切[19-22]。本實驗采用聚集態的Aβ損傷SH-SY5Y細胞模型，驗證與本課題組所研發的可穿膜重組TAT-tCNTF蛋白有關的幾種蛋白與多肽（TAT-tCNTF、TAT48-58和rhCNTF）的抗氧化應激效應，證實了TAT-tCNTF能增加Aβ25-35損傷的SH-SY5Y細胞模型的GSH水平和SOD酶活性，從而降低細胞內的過氧化水平和增加細胞對抗氧化應激的能力，提示TAT-tCNTF能改善體外Aβ損傷細胞模型中的氧自由基和氧化應激水平。實驗中發現TAT-tCNTF對非損傷模型的GSH和SOD也有促進作用，提示了TAT-tCNTF融合蛋白作為抗氧化應激效應預防用藥方面的價值。

有文獻證實HIV-1的TAT蛋白能增加細胞內的氧化應激水平[14-15]，從而誘導細胞的損傷和凋亡。TAT-tCNTF蛋白中的TAT48-58序列是上述蛋白的一段11個氨基酸的肽段，本實驗通過對其不同水平對SHSY5Y細胞的GSH水平和SOD酶活力檢測，并沒有發現其能夠降低兩者的水平，說明TAT48-58不能促進SHSY5Y細胞氧化應激的發生發展。同時也證實了與TAT連接后，CNTF發揮降低Aβ損傷模型細胞的過氧化水平不受影響，TAT-tCNTF產生的效果與rhCNTF的效果是無明顯差異的。進一步說明本實驗室制備的可穿膜重組融合蛋白能對AD疾病模型起到一定的調節和改善作用。但對于TAT-tCNTF的穿膜機制和對抗AD更深入的機制還有待于進一步研究。

本實驗采用析因設計，避免了對照不全的統計學錯誤，使實驗結果準確、可信。析因設計是因素各個水平的全組合設計，可分析每個因素及各因素間的交互作用對結果的影響，也可實現每兩個水平的兩兩比較，使數據結果所得到的信息能夠毫無遺漏的呈現出來，實驗結果的信息能夠充分利用。單因素多水平設計和析因設計方差分析的優點是能夠完整的綜合整個數據資料，減少了假陽性錯誤出現的概率。常用于兩組數據比較的t檢驗方法與單因素多水平設計和析因設計方差分析相比較，割裂了實驗設計的完整性，且在分析整個因素所引起的差異時難以給出準確的統計量和概率值。

本研究確證了TAT-tCNTF能提高Aβ損傷的SHSY5Y細胞模型的GSH水平和SOD活性的效應，并否認了來自HIV-1-TAT序列的片段TAT48-58可引起細胞內氧化應激作用，為TAT-tCNTF對抗AD的作用機制研究開拓了氧化應激方面的新思路，并為其作為預防和治療AD疾病藥物的進一步研發提供了藥效學依據。

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