添加混合菌劑對石油污染土壤的降解

陳麗華 ，馬金珠，雒曉芳，楊琴

(1.西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州，730030；

2.蘭州大學 西部環境與氣候變化研究院，甘肅 蘭州，730000；

3.長慶油田公司 油氣工藝研究院，陜西 西安，710012)

治理石油污染土壤的修復技術主要有物理修復、化學修復、生物修復以及綜合修復等[1-3]。其中，物理修復(如熱處理)可破壞土壤中的大部分污染物，但同時破壞了土壤組分和結構，而且價格昂貴；化學修復有較好的除油效果，但所用的化學試劑會產生二次污染，限制其應用范圍[4]。近年來，石油烴的生物降解受到越來越多的關注，在石油污染的生物處理中，石油降解菌以石油烴為碳源而將其降解[5-7]。石油降解微生物的資源研究已經成為一個重要研究方向，國際上已建成專門的降解微生物菌種資源庫[8]。污染土壤的石油組分復雜，單一的細菌或真菌產生酶的種類較少、濃度較低，一般只能降解少數特定烴類或者只降解到某一階段，某些復雜烴類的徹底降解往往需要多種微生物協同作用[9]。研究表明：加入高效降解菌能有效地強化生物修復速度和程度。如韓慧龍等[10]利用細菌和真菌在生長以及對石油類物質降解途徑方面的互補性，構建了以真菌和細菌組成的真菌-細菌混合菌劑，大大地提高了石油類物質的生物降解。另外，碳、氮和磷等主要營養元素缺乏也會限制微生物的生長，降低修復效率[11-13]。生物菌劑在我國處于研發階段，處理油污土壤的初始含量還處于低范圍(質量分數小于2%)，尤其是細菌、霉菌、放線菌混合的降油菌體系對油污土壤的生物修復未見報道。而降解研究大多針對具體石油組分含量的測定，未從物質構型轉化及石油組分群的生物演化參數方面去進行全面的降解演化研究。本文以甘肅隴東地區含油土壤為菌源，以原油為唯一的碳源進行篩選分離得到石油降解菌，分別為細菌，霉菌和放線菌。把5種菌屬的菌混合在一起制成混合菌劑，投加到5%油污染土壤中，將滯留的污染物快速降解和轉化。通過分析脫氫酶活性的變化，不同量有機肥中的氮、磷對石油類污染物降解的影響，研究土壤中微生物對石油污染物的修復性能的影響。同時，采用GC-MS分析混合菌對石油各組分群的降解演化規律，以期為后期的現場修復提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤及原油

所用的土樣和原油取自甘肅隴東地區，西峰市郊某油井及附近農田中未污染土樣；用西-27#原油作為微生物的唯一碳源。由于研究區油田散布于黃土塬農業區中，土壤中速效鉀是肥力的重要表征參數，總氮、有效磷、有機質既是土壤肥力表征參數，又是油污土壤微生物降解所需氮源、磷源、碳源的背景土壤。表1所示為背景土壤與生物降解有關的信息。

從背景土壤整體情況來看，隴東油區由于降雨量偏少，采樣時又為冬季，土壤含水率較低(5%左右)；pH為7.8左右，弱堿性，有利于微生物降解；總氮量較低0.180 g/kg，有機質含量低(1%左右)，土壤較為貧瘠；有效磷、速效鉀由于人工施肥背景值比荒地的高，但遠遠低于微生物降解所需要的氮磷含量；電導率普遍小于0.2 mS/cm，表現出土壤鹽度低的特點。

1.1.2 混合菌劑

以甘肅隴東地區西峰市油田附近的含油土壤為菌源，以原油為唯一碳源進行篩選分離，得到高效石油降解菌。經大連寶生物工程有限公司鑒定分別為：A6菌株屬于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌屬，D4菌株歸屬于蒙氏假單胞菌(P.monteilii)菌屬，A5菌株屬于魯菲不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)菌屬，F1 菌株屬于黃色類諾卡氏菌(Nocardioides luteus)菌屬，F2菌株屬暗黑微綠鏈霉菌(Streptomyces atrovirens)菌屬。把這5種菌屬的菌混合在一起制成混合菌劑。

表1 背景土壤基本信息Table1 Information of background soil

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬生物原位修復處理方法

取1 kg沒有被石油污染過的土壤澆透水1次后自然風干，分別按照 0，2%，4%和8%的比例加入混合菌劑和有機肥，混合均勻后在室溫下培養，每隔1 d澆1次，保持含水率在20%左右。每個處理設置 2個平行。分別于第 1，4，7，12，17，20，27，34，41，48和63天測定石油類污染物降解率、脫氫酶活性、土壤中的氮、磷含量以及電導率。

1.2.2 混合菌劑的制備

混合菌劑的培養采用的是三級擴大培養法，在37 ℃的恒溫箱中培養24 h，經平板稀釋法檢查菌落數大于1×1010個/mL后，以蚯蚓肥為載體將菌液吸附于載體上(載體與菌液的質量比為2.5:1)制備成菌劑，在室溫下保存。

1.2.3 分析方法

土壤中石油類物質的測定采用紫外分光光度法。用索式提取法提取土壤中石油類物質，在紫外分光光度計下測出相對應的吸光度，計算每千克干土中石油類物質含量，進而按下式計算石油類物質降解率R：

其中：w1為第1天土壤中石油類物質含量，mg/kg；wi為第i天土壤中石油類物質含量，mg/kg。

紫外分光光度法測得原油的標準方程為：

其中：相關系數R2為0.999 3。

為方便計算，將其轉變為250 mL樣品中所含的石油類總量和吸光度之間的關系式為：

其中：D為用250 mL石油醚萃取含油土樣得到萃取液的有效吸光度，無量綱；M為樣品所含石油類污染物總量，mg。

土壤樣品中脫氫酶活性的測定采用的是TTC分光光度法。通過把土壤溶液離心后加入TTC和Tris溶液并萃取后測定其吸光度，根據測得的吸光度和繪制的標準曲線計算出土壤中脫氫酶活性，脫氫酶活性系數表示土壤中微生物降解石油能力。

土壤中全氮的測定采用的是凱氏定氮法；土壤中有效磷用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；土壤中電導率采用電導法測定。

1.2.4 GS-MC測定降解后石油各組分

將混合菌株接入20 mL含10 mg原油的無機鹽培養基的三角燒瓶，于28 ℃搖床震蕩培養7 d，取出加入氯仿10 mL，放入超聲波儀器中破乳15 min，倒入滴液漏斗中萃取出氯仿相。如此反復3次，將萃取液收集一起，放入水浴中將氯仿蒸發殆盡，剩下的殘油準確稱量后定容10 mL，即為GS-MC測試降解油樣。同時不添加混合菌劑設置對照組。降解油樣各組分分析條件為：氣化溫度 260 ℃；載氣He；柱溫200 ℃；柱SE-30(50 m)；質譜條件為：電子能量70 eV，質量范圍40～450。

2 結果與討論

2.1 各菌株生長曲線

將實驗所需的5種菌種活化24 h后分別接種于營養肉湯中，每1種菌接種于11個單獨的小試管中。另外，接種1組包括5種菌劑的混合菌劑。將接種后的菌放置于溫度為37 ℃、轉速為80 r/min的振蕩培養箱中培養。每隔3 h取出每1種菌劑和混合菌劑的1組菌懸液，置于波長600 nm處測定光密度，用菌懸液光密度隨時間變化表示菌種的生長曲線，如圖1所示。

根據圖1，單個細菌的生長周期很明顯，有調整期、對數生長期、穩定期和衰退期?；旌暇谡{整期后都生長良好。但5種單菌的穩定期都很短，有的很快就到達衰減期。在混合菌的生長曲線中，接種后幾乎沒有調整期出現，很快適應新的環境并開始呈指數增長，可以看出其生長良好，調整期較短，對數期較長，各種菌的性能都達到最佳狀態，有利于提高石油的降解速率。

2.2 不同濃度的混合菌株對降油率的影響

不同濃度菌劑處理下的石油烴降解率的變化情況如圖2所示。從圖2可見：隨著培養時間的增長，各種處理下的石油類物質降解率不斷增加，中間階段時升時降，直至49 d后變化速率漸趨于穩定。前12 d幾種處理石油烴物質的降解率均較小，這是由于菌劑中的微生物加入土壤后需要一段時間適應土壤環境，加入的菌劑還沒有完全發揮其高效降解作用。14 d后石油降解速率加快，細菌在適應新環境之后開始迅速生長繁殖，使石油烴的降解率逐漸升高。其中加入有機肥與菌劑的土壤中石油的降解率與沒有添加任何組分(CK)相比要高的多。因為加入的有機肥本身含有大量容易被微生物利用的氮、磷元素，能夠刺激土著微生物的生長，同時，加入的菌劑與土著微生物的聯合作用提高降解效果。在第63天時，2%，4%和8%菌劑對5%油污土壤的降解率分別達到67.49%，80.18%和77.03%，是CK的1.67，1.98和1.90倍；而4%和8%菌劑的石油類物質降解率相差不明顯，4%菌劑的降解率略高于8%菌劑的降解率。這可能是加入菌劑量過多時，土壤自身環境條件對菌劑容納量有限而影響其存活率；有機肥中豐富的有機質可以促進土壤中的不同微生物的生長繁殖，但是，有機質的濃度過高，會抑制降油菌對石油的降解作用，導致降解率下降。

圖1 菌株生長曲線Fig.1 Curves of strain growth

2.3 混合菌降解石油主要組分規律研究

從原油GC-MS圖譜分析可知，該地區原油正構烷烴的碳數主峰靠前為nC15，高碳數正構烷烴降解明顯，奇數碳優勢已不夠明顯，霍烷和甾烷的異構化現象明顯，均說明成烴環境微生物發育，原油演化程度高，成熟度高。非烴和多環芳烴在成烴環境中熱、壓力能量和微生物作用下，已多數演化為類異戊二烯烷烴等烴類物質，在離子流圖中較難提取，含量很少。故以氯仿提取混合菌降解后原油進行GC-MS分析，其組分亦主要包括飽和烴(正構烷烴、霍烷、甾烷系列)，芳烴、非烴含量很少。對降解后主成分正構烷烴、霍烷系列的分析，結果見表2和表3。2系列總離子流圖見圖3和圖4。

圖2 添加不同濃度菌劑下的石油降解率RFig.2 Degradation rates of different contents of oil degradation bacteria

2.3.1 正構烷烴、類異戊二烯烷烴降解規律

原始油樣和經混合菌作用7 d的原油正構烷烴的碳數分布相同均為C14～C39，但經混合菌作用7 d的原油正構烷烴的主峰碳明顯前移，是混合菌具有選擇性對高碳數正構烷烴有較強烈的去甲基作用的反映。w(∑C21-)/w(∑C22+)參數顯示混合菌在降解正構烷烴時高碳數烷烴的降解速率明顯大于低碳數烷烴。原始油樣的成熟度高因而OEP變化不太明顯，但原始油樣的OEP比經混合菌作用7 d的原油樣品的大，表明混合菌在降解正構烷烴時奇數碳烷烴的降解速率大于偶數碳烷烴的降解速率。姥植比(w(Pr)/w(Ph))是利用類異戊二烯烷烴中常見的姥鮫烷與植烷的比值，研究樣品有機質氧化還原程度的有意義的參數。一般認為原油遭受混合菌不太強烈的降解時，類異戊二烯烷烴不受降解的影響。本研究發現：經受混合菌對原油作用7 d后其w(Pr)/w(Ph)比為0.644，明顯大于原油的0.578，反映出原油中類異戊二烯烷烴在混合菌7 d的作用過程中發生了明顯的降解，使部分植烷(C20H42相對分子質量M=282)脫去1個甲基轉化為姥鮫烷(C19H40，M=268)。w(Pr)/w(C17)和w(Ph)/w(C18)是姥鮫烷(Pr)與其相鄰的C17烷烴以及植烷(Ph)與其相鄰的C18烷烴的相關性參數，該值越大表明原油受混合菌作用時烷烴降解的速率越高。由表3可知：經受混合菌對原油作用7 d后其w(Pr)/w(C17)和w(Ph)/w(C18)均呈明顯的增大趨勢，表明原油受混合菌7 d作用過程中烷烴受到較明顯的降解，混合菌可以廣泛利用從C14～C39正構烷烴為碳源，降解率為42.8%～89%，類異戊二烯烷烴則比較穩定。w(∑hop)/w(∑)烷烴是反映藿烷在原油總離子流中相對強度的參數，經混合菌作用7 d的原油樣品該值明顯比原始油樣的大，表明混合菌在降解原油時環狀萜類化合物比烷烴系列穩定得多。

表2 各組試驗處理措施Table2 Each experimental treatment or measures

表3 降解后烷烴組分分析Table3 Analysis of alkane component after degradation %

圖3 降解后正構烷烴、類異戊二烯烷烴離子流圖Fig.3 TIC of remaining n-alkanes and isoprenoid alkanes after degradation

圖4 降解后霍烷離子流圖Fig.4 TIC of remaining hopane after degradation

2.3.2 霍烷降解規律

原始原油和經歷混合菌作用7 d的原油的藿烷系列碳數分布相同均為C27～C35(C28缺失)，主峰相同均為C30-αβ藿烷。w(Ts)/w(Tm)是石油地質領域常用的有機質演化程度參數，Ts為18α(H)-22,29,30-三降藿烷，Tm為17α(H)-22,29,30-三降藿烷。在生物體原生質中只有Tm構型是沒有Ts構型的，當這類生物進入地質體后在熱作用、微生物作用、壓力及礦物催化作用下三降藿烷將由Tm立體構型逐漸向更穩定的Ts立體構型轉化，因而w(Ts)/w(Tm)越大既反映了有機質受外作用力的程度越強。研究樣品主要改變的外作用力是混合菌作用，所以，w(Ts)/w(Tm)越大，則混合菌對有機質的降解越強烈。從表4可以看出：經混合菌作用過的樣品w(Ts)/w(Tm)均比原始油樣的大，因而混合菌作用能促使五環三萜類化合物立體構型中不穩定構型向穩定性構型轉化。大于31個碳的17α(H)和21β(H)構型的藿烷其第22位碳原子成為手性碳，因而會出現一對鏡像異構體(22S+22R)。由于在生物體中22R異常高而22S異常低，通常將22R構型稱作生物構型，將22S構型稱作生地質構型。當這類生物進入地質體后，在熱作用、微生物作用、壓力及礦物催化等外力作用下，22R將逐漸向22S轉化，其轉化終點值為w(22S):w(22R)=6:4。地球化學研究中常用C31αβ-22S/22(S+R)和C32αβ-22S/22(S+R)作為判識有機質演化程度的參數(該值大于0.400為成熟有機質，該值小于0.200為未熟有機質，介于0.200～0.400之間為低成熟有機質)。研究的原始油樣為成熟有機質，其C31αβ-22S/22(S+R)和C32αβ-22S/22(S+R)分別為0.591和0.577即將接近轉化終點值(0.600)，受外力作用變化不會很大。從表4可以看出經混合菌作用過的樣品C31αβ-22S/22(S+R)和C32αβ-22S/22(S+R)均大于原始油樣的該值，到達終點。因而，混合菌作用能促使五環三萜類化合物的手性碳R構型向更穩定的S構型轉化。

表4 降解后霍烷組分分析Table4 Analysis of hopane component after degradation

2.4 影響石油降解的因素分析

2.4.1 脫氫酶活性的變化

用752紫外分光光度計在波長486 nm處測得TTC標準曲線，得到標準曲線方程為：

其中：相關系數R2為0.993；y為不同濃度的TTC對應的吸光度；x為TTC質量濃度，μg/mL。

脫氫酶活性可以作為微生物氧化還原系統的指標，被認為能很好地估計土壤中微生物的氧化能力，土壤肥力和施肥方式可直接影響土壤脫氫酶活性。如圖5所示，隨著培養時間的增加，脫氫酶活性逐漸增大，說明在生物修復過程中微生物的活性在逐漸增強，這也與圖2中石油烴降解率變化趨勢大體相同。在培養過程中，0～4 d的脫氫酶活性變化曲線表明：向土壤加入菌劑的初期，一方面，有機肥的加入促進了土著微生物的生長；另一方面，外加菌劑進入新環境需要一定的適應時間的，上升趨勢平緩。隨著混合菌在土壤中適應性增強，細菌開始迅速增長，微生物活性明顯增加，在17 d時達到了最高峰，此時微生物降解土壤中石油烴物質效率最高；此后，微生物的活性逐漸降低，34 d后逐漸達到平衡，修復后期隨著石油烴類污染物的不斷消耗，難降解物質的大量積累以及代謝產物的積累導致微生物活性降低。實驗中由于添加的有機肥的含量不同，CK是沒有加任何菌劑和有機肥的對照組，但是，它的石油降解率的變化趨勢和2%的變化趨勢沒有很明顯的區別，說明加入少量菌劑和有機肥對石油降解速率的提高沒有明顯的作用。4%添加量的石油降解率的變化趨勢與8%的變化趨勢相比，4%添加量略大于8%的添加量，這是因為過量的有機肥會抑制細菌的增長。

2.4.2 氮磷含量與石油降解率的關系

圖5 添加不同濃度菌劑下的TTC質量濃度變化Fig.5 TTC concentration change of different concentrations of bacteria

微生物細胞的化學組成主要是碳、氫、氧、氮、磷和各種礦質元素，石油污染物提供的主要是碳、氫元素。本實驗中氮、磷由加入的蚯蚓肥提供。氮、磷營養物質是影響土壤中石油污染物生物降解的一個主要原因。不同菌劑下氮、磷質量分數與降解率的關系如圖6所示。由圖6可見：氮、磷的消耗量隨著石油降解率的增大而逐漸減少，說明石油降解菌在添加一定量的氮、磷時對石油烴的微生物降解均有明顯的促進作用。但是存在一個較經濟合理的添加量范圍。在本實驗菌劑量和土壤環境下，4%的有機肥添加量使降解效果達到最好。

2.4.3 降解率與電導率的關系

降解率與電導率的關系如圖7所示。從圖7可見：土壤中石油的降解率與土壤溶液中的電導率呈反比例關系。土壤溶液中的電導率主要受土壤全鹽含量。土壤含水量的影響，而本實驗中土壤的含水量保持在20%左右，對電導率的影響不大，本實驗電導率的主要影響因素是全鹽含量，圖5中由于有機肥是按照0，2%，4%和8%的量加入石油污染土壤中的，所以，對降解率的影響也不同。圖7(a)中由于沒有加入菌劑和有機肥，石油的降解主要是靠土壤中土著微生物的作用，開始由于石油的加入，提供了碳源，以及土壤中本身的礦物含量提供了氮磷等微生物生長所需的營養物質，微生物迅速增長，石油的降解率有所提高，但當土壤中的礦物含量慢慢減少時，電導率也呈下降趨勢。由于缺少生長所需營養物質，微生物的量開始下

降，石油的降解速率也下降。圖7(b)中由于加入的有機肥的含量少，所以，變化趨勢和圖7(a)的變化趨勢相似。圖7(c)和(d)中，由于加入的有機肥的量滿足微生物的生長需要，所以，微生物大量生長，石油的降解率明顯高于圖7(a)和(b)中的石油降解率。營養鹽的消耗使得土壤中的電導率呈下降趨勢，所以，石油降解率升高時，土壤電導率下降。

圖6 不同菌劑下氮、磷含量(質量分數)與降解率的關系Fig.6 Change of Nitrogen phosphorus and degradation rate under action of different concentrations of bacteria

圖7 不同菌劑下的降解率與電導率的關系Fig.7 Change of degradation rate and electrical conductivity under action of different contents of bacteria

3 結論

(1)由于只添加2%有機肥的菌劑，脫氫酶活性變化趨勢與未添加有機肥的變化趨勢相似。分別添加4%和8%有機肥的脫氫酶活性變化趨勢相差不大，添加4%有機肥的降解細菌含量有時略大于添加8%有機肥的細菌含量。這是因為添加的有機肥的含量不同決定的。但總的說來，添加一定量菌劑的石油降解率要比不添加或者添加少量菌劑量的石油降解率高，并且添加菌劑量不同其降解效率也不同。

(2)實驗中由于添加的有機肥的含量不同，導致石油降解率也不同。不加有機肥和加過量的有機肥都不能促進石油降解細菌更好地降解石油，只有添加適量的有機肥才能使降解細菌的降解效果最好。

(3)土壤溶液中電導率與石油降解率呈反比例關系，石油的降解率增加則土壤中的電導率下降。

(4)混合菌株降解石油規律是先降解高碳數正構烷烴為低碳數正構烷烴，高碳數正構烷烴中奇數碳向偶數碳正構烷烴演化；經受混合菌對原油作用7 d后其w(Pr)/w(Ph)為0.644，明顯大于原油的0.578，反應出原油中類異戊二烯烷烴在混合菌7 d的作用過程中發生了明顯降解，使部分植烷(C20H42，M=282)脫去1個甲基轉化為姥鮫烷(C19H40，M=268)。此外，菌株還能較好地促使五環三萜類化合物立體構型中不穩定構型向穩定性構型轉化。

[1]何良菊, 魏德洲, 張維慶.土壤微生物處理石油污染的研究[J].環境科學進展, 1999, 7(3): 110-115.HE Liang-ju, WEI De-zhou, ZHANG Wei-qing.Research of microbial treatment of petroleum contaminated soil[J].Advances of Environmental Science, 1999, 7(3): 110-115.

[2]Margesin R, Schinner F.Bioremedation (Natural Attenuation and Biostimulation)of diesel-oil-contaminated soil in an alpine glacier sking area[J].Appl Environ on Microbio, 2001, 67(7):3127-3133.

[3]李春榮, 王文科, 曹玉清, 等.石油污染物的微生物降解[J].地球科學與環境學報, 2007, 29(2): 214-216.LI Chun-rong, WANG Wen-ke, CAO Yu-qing, et al.Petroleum pollutions degraded by microorganisms[J].Journal of Earth Sciences and Environment, 2007, 29(2): 214-216.

[4]Kishore E D, Ashis K M.Crude petroleum-oil biodeg-radation efficiency of Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contami-nated soil from North-East India[J].Bioresource Tech-nology, 2007, 98(7):1339-1345.

[5]Alejandro R G, Mar A C, Ferre-R O, et al.Bioremediation of crude oil polluted seawater by a hydrocarbon-degrading bacterial strain immobilized on chitin and chitosan flakes[J].International Biodete-rioration & Biodegradation, 2006, 57(4): 222-228.

[6]Ayotamuno M J, Kogbara R B, Ogajs O T, et al.Bioremediation of a crude-oil polluted agricultural-soilat PortHarcourt,Nigeria[J].Applied Energy, 2006, 83(11): 1249-1257.

[7]Mark A S, James S B, Cheryl A P, et al.Evaluat ion of two commercial bio-augmentation products for enhanced removel of petroleum from a wet land[J].Ecological Engineering, 2004, 23:263-277.

[8]Sorkhoh N A, Ghannoum M A, Ibrahim A S, et al.Crude oil and hydrocarbon degrading strains of Rhodococcus rhodochrous isolated from soil and marine environments in Kuwait[J].Environ Pollut, 1990, 65(1): 1-17.

[9]顧傳輝, 陳桂珠.石油污染土壤生物降解生態條件研究[J].生態科學, 2000, 1(4): 67-71.GU Chuan-hui, CHEN Gui-zhu.Research of bioremediation condition of petroleum contaminated soil[J].Ecological science,2000, 1(4): 67-71.

[10]韓慧龍, 陳鎮, 楊健民, 等.真菌-細菌協同修復石油污染土壤的場地試驗[J].環境科學, 2008, 29(2): 454-461.HAN Hui-long, CHEN Zhen, YANG Jian-min, et al.Field scale demonstration of fungi-bacteria augmented remediation of petroleum contaminated soil[J].Environment Science, 2008,29(2): 454-461.

[11]丁克強, 尹睿, 劉世亮, 等.石油污染土壤堆制微生物降解研究[J].應用生態學報, 2002, 13(9): 1137-1140.DING Ke-qiang, YIN Rui, LIU Shi-liang, et al.Bioremediation for petroleum-contaminated soil by composting technology[J].Chinese Journal of Applied Ecology, 2002, 13(9): 1137-1140.

[12]何良菊, 李培杰, 魏德洲.石油類物質微生物降解的營養平衡及降解機理[J].環境科學, 2004, 25(1): 91-94.HE Liang-ju, LI Pei-jie, WEI De-zhou.Nutrient balance and mechanism of biological degradation of oil[J].Environment Science, 2004, 25(1): 91-94.

[13]喬俊, 陳威, 張承東.添加不同營養助劑對石油污染土壤生物修復的影響[J].環境化學, 2010, 29(1): 6-11.QIAO Jun, CHEN Wei, ZHANG Cheng-dong.Bioremediation of petroleum contaminated soil by various nutrient amendments[J].Environment Chemistry, 2010, 29(1): 6-11.