內皮素－1在慢性心力衰竭大鼠心肌的表達及生長激素釋放肽的干預作用

韓 曦 齊亞靈 田國忠 扈清云 魏 罡 王培軍 歐葉濤 張東東 陳乃峰 鐘堂武

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

慢性心力衰竭(CHF)是心血管疾病中一種常見的嚴重綜合征，死亡率高，預后差。研究表明細胞因子的激活，在CHF的發生、發展過程中起重要作用。內皮素－1(ET－1)在正常人血漿中含量較低，但CHF患者血漿中含量顯著升高，是判斷CHF的重要指標，對心衰的治療效果及預后判斷起到十分重要的作用。生長激素釋放肽(GHRP)是一類人工合成的短肽，具有廣泛的生物學效應。目前關于GHRP對細胞因子的影響報道較少，本實驗以ET－1作為研究對象，探討GHRP對心臟保護的分子生物學機制，以期為治療CHF提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 260～320 g健康Wistar大鼠(雄性)60只，由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑 鹽酸阿霉素(ADR，浙江海正藥業股份有限公司);GHRP－2(上海超研生物科技有限公司);ET－1 ELISA試劑盒(上海超研生物科技有限公司)。

1.3 動物分組及造模 大鼠隨機分為對照組、模型組和GHRP組，每組20只。對照組，腹腔注射(ip)與ADR等體積生理鹽水;模型組，第 2、4 天 ip ADR 1 mg/kg，第6、8 天 ip ADR 2 mg/kg，第10、12 天ip ADR 3 mg/kg，第14、16 天 ip ADR 4 mg/kg，去除死亡大鼠2只;GHRP組，ip ADR，方法同模型組，且第10～18天尾靜脈注射GHRP－2 25 g/kg，每天一次，第19天取材。

1.4 心功能測定 取材前描記肢體導聯心電圖;接小動物呼吸機;頸外靜脈插管，并注入肝素;頸總動脈插管，描記相關血流動力學指標。

1.5 心肌細胞形態學觀察 心功能測定后，沿前室間溝按長軸將心臟切成厚約4～5 mm的塊狀組織，固定，制成5 μm厚石蠟切片，在400倍鏡下觀察HE染色后心肌細胞形態變化。

1.6 ELISA法檢測心肌組織中ET－1含量 采用雙抗體夾心ABC－ELISA法，具體操作參照ELISA試劑盒說明書進行，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。建立回歸方程，計算出樣品實際濃度。

1.7 統計學分析 應用SPSS 13.0統計學軟件對實驗數據進行分析，結果用±s表示;組間數據的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 心功能變化 對照組大鼠心電圖正常，以R波為主;模型組QRS波峰降低，心率加快;GHRP組心電圖較模型組有所改善，見圖 1。模型組舒張期左室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)明顯低于對照組，且有明顯差異(P＜0.05)。GHRP組與對照組比較，±dp/dtmax無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心率、左室內壓最大變化速率的比較(±s)

表1 各組大鼠心率、左室內壓最大變化速率的比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 n 心率(次/min)+dp/dtmax(mmHg/s)+dp/dtmax(mmHg/s)對照組 20 342.10±25.73 3 717.30±602.391)3 250.75±606.721)模型組 18 383.06±27.841) 2 321.44±311.57 1 776.28±374.35 GHRP組 20 364.20±24.42 3 381.25±459.511)2 880.95±558.231)

圖1 各組大鼠心電圖

2.2 各組心肌組織HE染色結果 對照組大鼠心肌細胞排列整齊，結構清晰，橫紋明顯，細胞質豐富均勻，無炎性細胞浸潤;模型組心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，細胞間質水腫，細胞變性、溶解，染色變深，有不同程度的炎性細胞浸潤;GHRP組與對照組比較，心肌細胞的形態無明顯變化，見圖2。

2.3 各組心肌組織中ET－1含量 各組心肌組織中ET－1含量模型組(15.09±2.14)明顯高于對照組(3.84±0.47)和GHRP組(4.28±0.85)(P＜0.05);而 GHRP組與對照組比較，ET－1含量升高，但差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學結果(HE，×400)

3 討論

CHF是臨床上一種常見的危重病癥，死亡率較高。近年來對心衰的研究已成為我國乃至全球醫學界研究的重點。越來越多的研究表明:細胞因子的激活在CHF的病理生理和發病機制中起重要作用〔1，2〕。在細胞因子的網絡調控中，ET－1在正常生理情況下，含量很少，而在病理情況下，含量顯著升高〔3〕，可達幾倍，甚至幾十倍，ET－1濃度升高與CHF嚴重程度密切相關〔4〕，是CHF患者獨立的預后因素，但目前關于CHF時心肌組織中ET－1的變化，文獻報道較少。本實驗結果顯示心肌組織中的ET－1含量小于有關文獻報道的血漿中的濃度，這是因為血漿中ET－1含量來源較復雜而廣泛，心肌組織中ET－1的產生參與了血漿ET－1含量的組成，并且模型組心肌組織中ET－1的含量高于對照組。CHF越嚴重，心功能越差，ET－1含量越高，CHF經治療后心功能好轉，ET－1含量下降，提示ET－1水平反映了心功能損害的程度。推測發生CHF時，ET－1的表達增加，濃度升高〔5〕，心肌ETA 受體(ETAR)和ETB受體(ETBR)密度上調，處于衰竭中的心臟收縮功能進一步減退，而肺部與ET－1清除有關的ETBR的減少將進一步升高ET－1的水平。至于心肌組織中ET－1的變化在CHF發生、發展的具體機制尚需進一步探討。

本文結果顯示，經GHRP治療后，GHRP組與模型組比較，水腫的心肌細胞趨于正常，炎性細胞浸潤消失，心肌組織中ET－1的含量降低，推測GHRP可能通過腎素－血管緊張素－醛固酮系統(RAAS)，降低血管緊張素Ⅱ濃度，減少對心肌正常功能的損傷〔6〕;抑制交感神經激活，防止CHF向不良方向發展，從而改善心肌重塑，對CHF大鼠的心功能起到保護和改善的作用。心電圖顯示GHRP組心電圖較模型組有所改善，并且心率明顯下降，左室內壓最大上升和下降速率明顯增加，與國內外報道一致，表明GHRP能夠通過調節血流動力學來改善心功能〔7〕。

另外，亦有研究顯示GHRP改善心功能是通過神經體液因素的調控來實現的。De Gennaro Colonna等〔8〕實驗研究發現:GH的減少抑制了離體大鼠心臟部分前列環素(PGI2)的形成，并且能增強動脈平滑肌對血管緊張素Ⅱ的反應性，增強血管對內皮素－1 反應性，明顯減弱血管平滑肌對 NG－monomethyl－L－arginine(NO合成酶抑制劑)的反應性。GHRP能增高心肌中膽堿能神經纖維和腎上腺素能神經纖維密度，延緩心衰后的去神經支配，改善神經重構〔9〕。通過實驗研究已經認識到GHRP能夠降低心肌中ET－1的含量，說明GHRP能通過細胞因子的調控改善心功能。21世紀隨著心衰生物學治療的開展，GHRP可為有效改善CHF心臟生物學功能發揮更為積極作用。

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3 李 香，金 哲，崔 瑛，等.慢性心力衰竭與血漿一氧化氮、內皮素及前列環素動態變化的關系〔J〕.中國老年學雜志，2008;28(14):1425－7.

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5 Parker JD，Thiessen JJ.Increased endothelin－1 production in patients with chronic heart failure〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004;286(3):1141－5.

6 宋漢君，田國忠，韓 曦，等.GHRP對心衰大鼠心功能及細胞因子的影響〔J〕. 中國老年學雜志，2011;31(14):2691－2.

7 Xu XB，Cao JM，Pang JJ，et al.The positive inotropic and calcium－mobilizing effects of growth hormone－releasing peptides on rat heart〔J〕.Endocrinology，2003;144(11):5050－7.

8 De Gennaro Colonna V，Rossoni G，Bernareggi M，et al.Cardiac ischemia and impairment of vascular endothelium function in hearts from growth hormone－deficient rats:protection by hexarelin〔J〕.Eur J Pharmacol，1997;334(2－3):201－7.

9 馮 佳，田國忠，趙 勇，等.生長激素釋放肽對心衰大鼠植物神經重構的影響〔J〕. 神經解剖學雜志，2009;25(4):453－6.