超高效液相色譜法測定人參中人參皂苷Re 的含量

孫全樂，蔡廣知，貢濟(jì)宇#（1.長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，長春130031；.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117）

美國Waters公司在2004年推出了一種新的液相色譜技術(shù)——超高效液相色譜（UPLC）[1]，它采用1.7 μm粒徑的色譜柱填料，能獲得更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)使柱效保持恒定，因而有利于提高流動相流速、縮短分析時(shí)間、提高分析通量。通過性能優(yōu)越的色譜柱，精確梯度控制的超高壓液相色譜泵，低擴(kuò)散、低交叉污染的自動進(jìn)樣系統(tǒng)及高速檢測器，使UPLC的峰容量、分析效率、靈敏度較常規(guī)高效液相色譜（HPLC）[2～4]有了很大的提高，為復(fù)雜體系的分離分析提供了良好的平臺。

人參皂苷是人參中的主要活性成分，已確定結(jié)構(gòu)的人參皂苷至少在30種以上[5，6]。近年來，人們圍繞著人參皂苷的提取、分離、結(jié)構(gòu)鑒定、含量測定、藥理等方面展開了深入細(xì)致的研究，而人參皂苷的含量測定方法是重點(diǎn)研究課題之一。目前常用的HPLC法雖可達(dá)到分離效果，但此法耗時(shí)過長、溶劑用量大、成本高。因此，筆者采用UPLC法對人參中人參皂苷Re的含量進(jìn)行測定，并與HPLC法進(jìn)行比較，旨在確定更高效、快速和準(zhǔn)確的測定方法，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UPLC儀，含ACQUITY UPLC紫外檢測器、Empower工作站（美國Waters公司）；KQ-2200E型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：50 kHz）。

人參藥材購于長春市各藥房（吉林大藥房、吉深大藥房、永新大藥房、吉林宏檢公司、普天大藥房、仁德大藥房），經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張雅芝教授鑒定均為真品；人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110810-200609）；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters patened hybrid particle細(xì)內(nèi)徑柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-水（19∶81）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm。

2.2 對照品溶液的制備[7]

精密稱取人參皂苷Re對照品適量，加甲醇制成濃度為0.2 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取人參粗粉5 g，加8倍量水浸泡12 h，放入超聲波提取器中，30℃下超聲提取20 min，共提取3次，合并提取液，抽濾，水液用水飽和正丁醇萃取5次（20、20、20、15、15 mL），合并正丁醇液，用1%NaOH洗滌2次，每次20 mL，棄去堿液，再用正丁醇飽和水洗滌3次（20、20、15 mL），棄去水液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 含量測定方法

采用外標(biāo)法測定。分別吸取對照品溶液和供試品溶液5 μL注入U(xiǎn)PLC儀，記錄保留時(shí)間和峰面積積分值。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 檢測波長的選擇 取人參皂苷Re對照品溶液在190～240 nm波長范圍內(nèi)作光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re在203 nm波長處有最大吸收，故選擇203 nm作為檢測波長。

2.5.2 流動相的選擇 考察以不同體積比的乙腈-水（40∶60、30∶70、20∶80、19∶81）體系作為流動相的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈-水的體積比為19∶81時(shí)，人參皂苷色譜峰峰形穩(wěn)定、無脫尾、分離完全，故最終確定以乙腈-水（19∶81）作為試驗(yàn)用流動相。

2.5.3 專屬性考察 取人參皂苷Re對照品溶液、陰性對照溶液（甲醇）和供試品溶液按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示陰性對照溶液在人參皂苷Re峰保留時(shí)間處無干擾峰，人參皂苷Re峰達(dá)到有效分離，理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計(jì)算應(yīng)為6 000，表明本方法專屬性良好。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取人參皂苷Re對照品20.04 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝9 029X－16 060.2（r＝0.999 8，n＝5）。結(jié)果表明，人參皂苷Re的質(zhì)量濃度在0.531～1.239μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取人參皂苷Re對照品溶液5 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及峰面積積分值。結(jié)果，RSD＝1.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于配制后0、0.5、1、2、3、5 h注入U(xiǎn)PLC儀測定，記錄色譜圖及峰面積積分值。結(jié)果，RSD＝1.03%（n＝6），表明室溫下供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品適量，精密加入一定量的人參皂苷Re對照品（1∶1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述方法測定樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.5.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品適量，共6份，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，精密吸取5 μL注入U(xiǎn)PLC儀。結(jié)果，人參皂苷Re含量的RSD＝0.08%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 樣品含量測定結(jié)果

取在不同藥店購買的人參藥材樣品適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，吸取5 μL注入U(xiǎn)PLC儀，記錄色譜圖并計(jì)算人參皂苷Re的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of content determination of the sample（n＝3）

3 討論

3.1 UPLC法與HPLC法的比較

與HPLC法比較，UPLC法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：超高分離度、超高速度、超高靈敏度，具體如下：

3.1.1 縮短分析時(shí)間 中藥材的成分十分復(fù)雜，需要高效和快速的分離分析方法測定其復(fù)雜組成。常規(guī)HPLC法測定人參皂苷Re的含量一般需要1 h左右的時(shí)間，樣品組分才能得到較好的分離（見圖1）；而采用UPLC法只需一半甚至更短的時(shí)間就能得到更好的分離效果和分析結(jié)果，測定人參皂苷只需在10 min內(nèi)就可完成試驗(yàn)（見圖2），如采用梯度洗脫的方式，還可進(jìn)一步縮短分析時(shí)間[8]。

圖1 高效液相色譜圖（引用文獻(xiàn)[8]）A.人參皂苷Re對照品；B.供試品；C.陰性對照Fig 1 HPLC chromatograms（referred literatures[8]）A.ginsenoside Re control；B.test sample；C.negative control

圖2 超高效液相色譜圖A.人參皂苷Re對照品；B.供試品；C.陰性對照Fig 2 UPLC chromatogramsA.ginsenoside Re control；B.test sample；C.negative control

3.1.2 增加峰容量，提高靈敏度 梯度條件下UPLC的峰容量變化已有報(bào)道[8～10]，該報(bào)道以小分子藥物為研究對象，認(rèn)為流動相比例、梯度洗脫時(shí)間、流速、色譜柱長度對峰容量影響最大，短柱、快速梯度變化可獲得很高的峰容量；或增加分析時(shí)間，即使使用長柱也會獲得更高的峰容量。UPLC使用1.7 μm粒徑的色譜柱填料，使色譜柱的柱效極大提高、色譜峰變窄、峰容量增加。如圖1和圖2中，UPLC圖中前5 min內(nèi)共有5個(gè)色譜峰達(dá)到完全分離，而HPLC圖中前40 min內(nèi)共有6個(gè)色譜峰分離完全。此外，UPLC進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，最高峰的吸收值為0.20 AU；HPLC進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，與UPLC中最高峰的對應(yīng)吸收值為1.70 AU，經(jīng)過換算可得UPLC的靈敏度是HPLC的7倍左右。UPLC的高靈敏度優(yōu)勢對微量組分的研究具有重要意義。

3.2 方法轉(zhuǎn)換

在保證相同分離度的條件下，UPLC與HPLC可以進(jìn)行簡單的方法轉(zhuǎn)換，使HPLC上50 min完成的分析在UPLC上不到8 min即可完成。在相同分離機(jī)制條件下，主要轉(zhuǎn)換流速、進(jìn)樣量及流動相梯度條件：根據(jù)轉(zhuǎn)換軟件，HPLC上10 μL的進(jìn)樣量在UPLC上為5 μL，HPLC上1 mL·min-1的流速轉(zhuǎn)換到UPLC上為0.21 mL·min-1，從而使在HPLC上50 min完成的分析在UPLC上用21.78 min即可完成；在儀器壓力允許及保證分離度的前提下，UPLC可適當(dāng)增大流速，最大可達(dá)0.6 mL·min-1，在此條件下，7.62 min即可完成分析。本試驗(yàn)應(yīng)用此轉(zhuǎn)換方法，原HPLC轉(zhuǎn)換為UPLC的條件為進(jìn)樣量5 μL、流速0.21 mL·min-1，可在10 min內(nèi)完成分析；當(dāng)增大流速為0.4 mL·min-1時(shí)，測試時(shí)間可縮短至5 min。

3.3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用UPLC法測定人參中人參皂苷Re的含量，供試品溶液在10 min內(nèi)分離完全，檢測時(shí)間比HPLC法縮短了30 min，可見UPLC能夠更快、更好地完成以往HPLC的工作。UPLC不但可以節(jié)省時(shí)間、提高效率、減少溶劑的消耗，還能為質(zhì)譜提供最佳的色譜條件，為中藥的分析建立良好的平臺，為信息庫的建立奠定良好的基礎(chǔ)。有理由相信，UPLC法的超高分析速度、超高靈敏度，必將會在復(fù)雜中藥體系的分離測試領(lǐng)域開創(chuàng)嶄新局面。

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