經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠血清對(duì)海馬神經(jīng)元5-HT1AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響Δ

金航，張惠云（山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250355）

近年來(lái)，經(jīng)前期綜合征（Premenstrual Syndrome，PMS）已成為情志病證研究領(lǐng)域的代表性病種，本課題組的前期研究[1]已證實(shí)，41.9%的育齡婦女均有不同程度的PMS。PMS肝氣郁證是PMS的主要亞型，是肝疏泄不及的表現(xiàn)，是以經(jīng)前出現(xiàn)抑郁寡歡等情緒異常，月經(jīng)來(lái)潮后癥狀自行消失為主要臨床表現(xiàn)的病證。現(xiàn)已證實(shí)PMS癥狀的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺（Serotonin，5-HT）能神經(jīng)異常密切相關(guān)[2]。Ho HP等[3]等通過(guò)對(duì)5-HT受體及其與之相耦聯(lián)的G蛋白研究認(rèn)為，PMS的產(chǎn)生可能與5-HT受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)。但目前對(duì)與編碼控制5-HT合成、釋放、重?cái)z取、代謝以及受體活性有關(guān)的基因研究較少，如5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（Serotonin transporter，SERT）基因、單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）基因、5-羥色胺1A受體（Serotonin receptor-1A，5-HT1AR）基因等。

為了進(jìn)一步探索PMS肝氣郁證發(fā)病的微觀作用機(jī)制，本課題組從細(xì)胞水平研究PMS肝氣郁證大鼠血清對(duì)海馬原代神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白和基因表達(dá)的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速低溫離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；低溫冰箱（日本三洋公司）；CO2培養(yǎng)箱（上海力新有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；Tecan酶標(biāo)儀（上海麥莎生物科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)、FR-200A全自動(dòng)紫外-可見分析儀（上海復(fù)日科技有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（大連寶生物工程有限公司）；ks 400圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)Zeiss公司）。

1.2 試藥

經(jīng)前舒顆粒（秦皇島市山海關(guān)制藥廠，批號(hào)：Z20053087）；神經(jīng)基質(zhì)、B27、谷氨酰胺（美國(guó)Gibico公司）；胎牛血清、多聚賴氨酸、MAO-B兔抗（批號(hào)：M1821）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RNAisoTMPlus、Taq HS（不含 dNTP Mixture）、Rnase 抗化劑、dNTP Mixture、DL2 000 marker、Promega的RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；預(yù)染蛋白marker（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；BeyoECL Plus試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；5-HT1AR兔抗（批號(hào)：ab44635）、驢抗兔二抗（批號(hào)：ab16284）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；驢抗羊二抗（批號(hào)：sc-2020）、MAO-A羊抗（批號(hào)：sc-18396）均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；SERT兔抗（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：AB1594P）。

表1 引物序列與RT-PCR反應(yīng)參數(shù)Tab 1 The gene sequences of primers and RT-PCR reaction parameters

1.3 動(dòng)物與神經(jīng)元細(xì)胞

SPF級(jí)健康SD大鼠36只，♀，體重180～220 g；新生SD乳鼠（24 h）5只，均由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20050015）。大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞由山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

2 方法

2.1 復(fù)制模型與含藥血清的制備

篩選處于非接受期的SD大鼠36只，隨機(jī)均分為正常、模型、經(jīng)前舒組。根據(jù)文獻(xiàn)方法[4，5]，將模型組和經(jīng)前舒組大鼠前足與對(duì)側(cè)后足用無(wú)菌紗布捆縛，妨礙其自由活動(dòng)，以大鼠稍能活動(dòng)、取食為度。復(fù)制模型同時(shí)，經(jīng)前舒組大鼠給予經(jīng)前舒顆粒（10 g·kg-1，相當(dāng)于人臨床8倍劑量[6]）；正常、模型組大鼠給予相同體積的滅菌飲用水（10 mL·kg-1）。ig給藥，每天1次，連續(xù)5 d。復(fù)制模型、給藥完成后即進(jìn)行宏觀行為學(xué)觀察和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)[7]。

給藥完畢斷頭取血，離心，收集血清，－70℃貯藏。使用前56℃滅活30 min，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

2.2 大鼠血清中5-HT含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]加以改進(jìn)色譜條件。色譜柱：ZORBA×SB-C18（250 mm ×4.6 mm ，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇18%（V/V）-乙酸鈉（100 mmol·L-1）-檸檬酸（85 mmol·L-1）-正二丁胺（0.4 mmol·L-1）-辛烷基磺酸鈉（1.5 mmol·L-1）-乙二胺四乙酸（EDTA，0.2 mmol·L-1），調(diào)pH值至3.7；抽濾、脫氣；流速：0.9 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：18 ℃；工作電壓：0.4 mv；量程：1 μA。

2.3 RNA提取與RT-PCR檢測(cè)

將培養(yǎng)的新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞分為3組，分別加入正常、模型、經(jīng)前舒組大鼠血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR半定量方法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的mRNA相對(duì)表達(dá)量。按照RNAisoTMPlus試劑盒和Promega的RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)目的cDNA序列，用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 3）設(shè)計(jì)引物，由濟(jì)南博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列與RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見表1（以β-actin作為內(nèi)參，按下列公式計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)豐度：被檢測(cè)基因表達(dá)豐度＝被檢測(cè)基因光密度值/β-actin光密度值；Tm為解鏈溫度）。

2.4 蛋白提取和Western blot法檢測(cè)

分組消化收獲35 mm培養(yǎng)皿對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗滌1遍，加入100 μL RIPA（含1 mL PMSF：100∶1）冰浴裂解細(xì)胞，提取蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，繪制濃度曲線。加入β-actin作為內(nèi)參，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（1 h）。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，分別與一抗（1∶200）于4℃孵育過(guò)夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，BeyoECL Plus A液和B液顯色，曝光，對(duì)mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。顯色過(guò)的NC膜用洗脫液室溫洗脫15 min，再用β-actin抗體孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用KS400圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，以5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT基因的蛋白光密度值與對(duì)應(yīng)內(nèi)參光密度值的比值作為該樣品中5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT蛋白相對(duì)表達(dá)量參數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用±s表示。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠宏觀行為學(xué)觀察及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

與正常組比較，模型組大鼠不活躍，精神萎靡，眼神呆滯，相互扎堆睡覺，對(duì)外界刺激不敏感；用電筆刺激，正常組大鼠激惹時(shí)常迅速躲開，模型組大鼠亦逃避電筆刺激，但反應(yīng)遲緩，速度較慢；而經(jīng)前舒組大鼠變化不明顯。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中水平得分和垂直得分分別反映動(dòng)物的興奮性和動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，而曠場(chǎng)總分是動(dòng)物探索行為和興奮性的總體反映。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠水平得分、垂直得分和曠場(chǎng)總分均顯著減少（P＜0.01），結(jié)合宏觀行為學(xué)觀察初步判定模型復(fù)制成功；與模型組比較，經(jīng)前舒組大鼠水平得分、垂直得分和曠場(chǎng)總分均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），初步說(shuō)明經(jīng)前舒顆粒可緩解PMS肝氣郁證癥狀。大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分見圖1。

3.2 大鼠血清中5-HT含量的測(cè)定

與正常組比較，模型組5-HT含量降低1/2左右（P＜0.01），經(jīng)前舒組則無(wú)顯著性差異；與模型組比較，經(jīng)前舒組5-HT含量顯著升高（P＜0.01）。大鼠血清中5-HT含量分析比較結(jié)果見表2。

3.3 大鼠血清對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SERT、MAO-A、MAO-B、5-HT1AR mRNA表達(dá)量的影響

運(yùn)用RT-PCR半定量方法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。與加入正常組大鼠血清的神經(jīng)元細(xì)胞比較，模型組大鼠血清的干預(yù)能顯著影響海馬原代神經(jīng)細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)：MAO-A mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），5-HT1AR、SERT mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），可推測(cè)海馬神經(jīng)元中MAO-A、SERT、5-HT1AR表達(dá)異常可能是導(dǎo)致經(jīng)前抑郁的重要病因之一。加入經(jīng)前舒干預(yù)大鼠血清能顯著改變神經(jīng)元中相關(guān)基因表達(dá)水平異常升高或降低的狀態(tài)。本研究未發(fā)現(xiàn)MAO-B基因表達(dá)顯著增高或降低的現(xiàn)象，說(shuō)明經(jīng)前舒顆粒可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MAO-A、5-HT1AR、SERT基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的。大鼠原代神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的RT-PCR電泳圖見圖2；大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比值見表3。

圖1 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)得分與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01 Fig 1 Score of the open field testvs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

表2 大鼠血清中5-HT含量分析比較結(jié)果（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of 5-HT content in rat serum（±s，n＝8）

表2 大鼠血清中5-HT含量分析比較結(jié)果（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of 5-HT content in rat serum（±s，n＝8）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常組模型組經(jīng)前舒組5-HT/ng·mL-1 3 109.16±188.86 1 433.77±358.04＊2 904.15±292.60#

圖2 大鼠原代神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B的RT-PCR電泳圖A.5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；B.5-羥色胺1A受體；C.單胺氧化酶-A；D.單胺氧化酶-B；M.DL2000 makerFig 2 RT-PCR electrophoretogram of 5-HT1AR，SERT and MAO-A，MAO-B in primary cultured neuronA.SERT；B.5-HT1AR；C.MAO-A；D.MAO-B；M.DL2000 marker

3.4 大鼠血清對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元SERT、MAO-A、MAO-B、5-HT1AR蛋白表達(dá)量的影響

運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)不同組大鼠血清對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白表達(dá)量的影響。與正常組比較，模型組大鼠血清的干預(yù)能顯著影響海馬原代神經(jīng)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)：MAO-A蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而5-HT1AR、SERT 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)前舒干預(yù)大鼠血清則能顯著改變神經(jīng)元中相關(guān)蛋白表達(dá)水平異常升高或降低的狀態(tài)。本研究未發(fā)現(xiàn)MAO-B蛋白表達(dá)顯著增高或降低的現(xiàn)象，說(shuō)明經(jīng)前抑郁可能與大鼠海馬中MAO-A、5-HT1AR、SERT蛋白表達(dá)異常有關(guān)，而經(jīng)前舒顆粒可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這幾個(gè)基因來(lái)發(fā)揮作用的。Western blot方法分析大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B見圖3；大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比見表4。

表3 大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比值（±s，n＝3）Tab 3 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

表3 大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比值（±s，n＝3）Tab 3 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

與正常組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常組模型組經(jīng)前舒組SERT 0.523±0.048 0.237±0.033＊0.477±0.069#5-HT1AR 0.303±0.042 0.221±0.021＊0.305±0.048#MAO-A 0.597±0.153 1.132±0.132＊0.509±0.187#MAO-B 0.268±0.041 0.272±0.042 0.261±0.047

圖3 Western blot方法分析大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中5-HT1-AR、SERT、MAO-A、MAO-BA.5-羥色胺1A受體；B.5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；C.單胺氧化酶-A；D.單胺氧化酶-BFig 3 Western blot analysis of 5-HT1AR，SERT，MAO-A、MAO-B in primary hippocampal neuronsA.5-HT1AR；B.SERT；C.MAO-A；D.MAO-B

表4 大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比（±s，n＝3）Tab 4 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

表4 大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B與內(nèi)參光密度比（±s，n＝3）Tab 4 The optical density ratio of internal reference to 5-HT1AR，SERT，MAO-A，MAO-B in primary hippocampal neurons（±s，n＝3）

與正常組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常組模型組經(jīng)前舒組MAO-B 0.315±0.120 0.310±0.108 0.317±0.177 5-HT1AR 0.417±0.060 0.203±0.037＊0.405±0.018#SERT 0.232±0.049 0.113±0.010＊0.189±0.022#MAO-A 0.377±0.060 0.532±0.040＊0.414±0.035#

4 討論

中醫(yī)藥理論認(rèn)為，肝臟疏泄功能失常是PMS的重要發(fā)病機(jī)制，疏泄太過(guò)產(chǎn)生肝氣逆證；疏泄不及產(chǎn)生肝氣郁證。PMS肝氣郁證的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大多處于假說(shuō)階段。

5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，普遍認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT能神經(jīng)功能系統(tǒng)發(fā)生紊亂可能導(dǎo)致一系列不良情緒，如焦慮、抑郁、恐懼等的發(fā)生。5-HT1AR和情感障礙關(guān)系最為密切[9]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者海馬5-HT1AR的結(jié)合率下降、mRNA減少[10，11]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)引起5-HT釋放到突觸間隙時(shí)，5-HT可被SERT再攝取到突觸前的5-HT神經(jīng)元，重新循環(huán)釋放或被MAO降解[12]。Ravary A等[13]制備了SERT基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)其5-HT的再攝取減少。另有研究表明，SERT敲除小鼠更容易有焦慮[14]和抑郁情緒[15]。MAO是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的一種重要代謝酶，分A和B兩型（MAO-A、MAO-B）[16]。MAO-A是5-HT合成及代謝的關(guān)鍵酶，與女性抑郁癥的發(fā)病有關(guān)[17]。MAO-B可通過(guò)生物激活神經(jīng)毒素或是升高有害的H2O2的水平來(lái)加速大腦的老化[18]。

由本研究結(jié)果可以推測(cè)，血清中5-HT含量的改變是影響海馬神經(jīng)元中5-HT1AR、SERT、MAO-A、MAO-B蛋白和基因表達(dá)的重要原因。根據(jù)PMS肝氣郁證與4種基因蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，可以進(jìn)一步揭示PMS肝氣郁證的發(fā)病機(jī)制。本研究?jī)H就目前研究結(jié)果初步推斷，PMS肝氣郁證可能與5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常有關(guān)，這種異常可能與5-HT含量有關(guān)，而經(jīng)前舒中的某些有效成分或其代謝成分可能通過(guò)影響5-HT的含量或直接作用調(diào)整5-HT1AR、MAO-A、MAO-B、SERT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮治療PMS肝氣郁證的作用，但目前其具體作用機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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