青蒿素衍生物對非小細胞肺癌A549細胞增殖的影響

趙 昉 廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所 廣州 510405

鄭紹琴 廣州中醫(yī)藥大學碩士研究生

青蒿素是從中藥菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L）的葉中提取而來，其衍生物包括：青蒿素（artemisinin）、青蒿琥酯（artesunate，Art）、雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）等。青蒿素的藥理作用廣泛，包括抗瘧原蟲、抗腫瘤、免疫抑制、抗病毒、抗孕等多種活性藥理作用[1-4]。本研究通過對青蒿素、青蒿琥酯、雙氫青蒿素對肺癌A549增殖的影響，觀察不同青蒿素衍生物的抗腫瘤作用。

1 實驗材料

1.1 細 胞 非小細胞肺癌A549，引自美國ATCC，由本室凍存?zhèn)鞔９堋?/p>

1.2 藥 物 青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿琥酯，由廣東新南方青蒿科技有限公司提供。陽性藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號101103，規(guī)格0.25g/10 mL。1.3 試劑儀器 低糖DMEM、HEPES均購自美國GIBCO公司；小牛血清購自廣州畜牧場，批號20100618；L-谷氨酰銨和MTT均購自Sigma公司；其他相關(guān)產(chǎn)品為國產(chǎn)試劑。美國寶特ELX800型全自動酶標儀、全自動CO2孵箱(上海力申科學儀器有限公司，型號：HF90），倒置顯微鏡（日本 Olympus，型號CK40）、海爾生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司，型號：HR40-ⅡA2）。

2 實驗方法

初步檢測A549的細胞倍增時間和青蒿琥酯、雙氫青蒿素、青蒿素在A549的半數(shù)毒性濃度。結(jié)合初步實驗結(jié)果，選取TC10作為后續(xù)實驗濃度，觀察各青蒿素衍生物對A549肺癌細胞增殖的影響。

2.1 細胞接種 常規(guī)復蘇細胞后，待細胞生長至一定數(shù)量后，用0.25%胰酶消化1～5 min，終止消化，并用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5.0×105/mL，按0.1 mL/孔接種于96孔細胞板上，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)。

2.2 A549細胞生長曲線的繪制 按2.1方法接種細胞，于接種后每24 h做一次MTT染色。每天取4個復孔細胞進行MTT染色，連續(xù)9天。最后結(jié)果以細胞MTT染色OD490為縱坐標，實驗時間為橫坐標，利用回歸法求出細胞增殖時間。

2.3 青蒿素衍生物半數(shù)毒性濃度TC50測定 按2.1方法接種細胞，根據(jù)A549生長曲線的結(jié)果，選取上藥時間為細胞接種后12 h，實驗周期為4天。在接種細胞12 h后棄細胞上清液，按以下各青蒿素衍生物稀釋濃度加入細胞板中，0.1 mL/孔，4復孔/濃度。青蒿素起始濃度為20 mmol/L，雙氫青蒿素起始濃度為500 μmol/L，青蒿琥酯起始濃度為500 mol/L，各青蒿衍生物以倍比稀釋法稀釋，共8個梯度濃度。陽性藥物5-氟尿嘧啶起始濃度為20 mmol/L，4倍梯度稀釋共5個濃度，同時設置不加藥物的正常對照組和含1%DMSO的溶媒對照組。上藥后繼續(xù)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4天，終止實驗。用MTT法檢測各青蒿素衍生物對A549的毒性作用，在酶標儀下以490nm波長讀取其OD值。按照下列公式計算：細胞存活率=(正常對照組OD值－實驗組OD值）/(正常細胞對照組OD值－溶媒對照組OD值）×100%。再根據(jù)Reed-Muench法計算各青蒿素衍生物的TC50。

2.4 青蒿素衍生物對非小細胞肺癌A549細胞增殖的影響 根據(jù)2.3所得結(jié)果，選取青蒿素200μmol/L、雙氫青蒿素 5μmol/L、青蒿琥酯 8μmol/L、5-FU。在細胞接種24h后，棄上清液，分別加入含以上各濃度的青蒿素衍生物培養(yǎng)基，同時設立只加正常培養(yǎng)基的對照組。0.1mL/孔，4個復孔/濃度，在上藥后分別于第 1、2、3、4、5、6 和第 7 天分別取樣做動態(tài) MTT，觀察青蒿素衍生物對A549細胞增殖的影響。

3 實驗結(jié)果

3.1 A549細胞倍增時間的測定 通過回歸分析，A549細胞的倍增時間為9.6 h，生長高峰期在接種后的第4天出現(xiàn)。根據(jù)初步的實驗結(jié)果，選取細胞接種后12 h為上藥時間，實驗周期選5天為1個周期。結(jié)果見表1。

表1 MTT法測定非小細胞肺癌A549細胞生長曲線（±s）

表1 MTT法測定非小細胞肺癌A549細胞生長曲線（±s）

OD 1天0.23±0.11 2天0.65±0.08 3天1.15±0.21 4天 5天1.22±0.17 1.18±0.13 490 6天1.05±0.23 7天 8天 9天0.64±0.01 0.58±0.21 0.33±0.05

3.2 青蒿素衍生物半數(shù)毒性濃度TC50的測定 在A549細胞上，青蒿素、雙氫青蒿素和青蒿琥酯的半數(shù)毒性濃度 TC50分別為 1.77 mmol/L、58.24 μmol/L、64.33 μmol/L。陽性對照物5-FU的半數(shù)毒性濃度為1.18 mmol/L。根據(jù)初步結(jié)果顯示，雙氫青蒿素和青蒿琥酯對A549肺癌細胞的抑制作用較好，其劑量濃度達到微摩爾水平。與雙氫青蒿素、青蒿琥酯相比，青蒿素的作用稍微差，為1.77 mmol/L，比陽性對照物5-FU稍大。顯示雙氫青蒿素抗肺癌A549作用最好，青蒿琥酯次之，青蒿素較差，見表2。

3.3 青蒿素衍生物對A549細胞增殖的影響 正常對照組細胞的倍增時間為11.2 h，第4天達到生長高峰期，從第5天開始，由于受到接觸抑制和養(yǎng)分耗竭的影響，細胞活性逐漸下降。青蒿素200 μmol/L組的細胞倍增時間為9.6 h，在第5天到達生長高峰期后細胞活性迅速下降。青蒿琥酯8 μmol/L組的細胞倍增時間為27.8 h，在第5天到達生長高峰期后細胞活性迅速下降；雙氫青蒿素5 μmol/L組的細胞倍增時間為36.6 h，在第5天到達生長期，見圖1。

4 討論

近年研究顯示，青蒿素類藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，主要通過抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡途徑完成。在青蒿素各衍生物中都有一個過氧化物橋活性基團，在其抗瘧原蟲的研究中指明青蒿素抗瘧的機制是由于過氧化物橋可以與二價鐵反應生成自由基，最終產(chǎn)生自由基活性代謝物,損傷蟲體細胞膜結(jié)構(gòu)以達到抗瘧目的。有學者認為青蒿素衍生物抗腫瘤的機制與抗瘧機制相似。由于鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達在腫瘤細胞上表達都較高[5]，尤其是進入G1期細胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達和鐵離子攝入都顯著增多[6]，因此青蒿素針對此周期的細胞具有特異性的靶向性，在高濃度的Fe2+離子催化作用下氧橋斷裂產(chǎn)生活性自由基，破壞細胞的線粒體的完整性，同時也可以通過調(diào)控細胞周期，下調(diào)增殖細胞核抗原（PCNA）和Bcl-2基因的表達，影響拓撲異構(gòu)酶活性等，誘導細胞進入凋亡程序。也有學者認為，青蒿素類藥物可以通過線粒體依賴途徑，降低線粒體膜電位等途徑誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡[7]。

表2 半數(shù)毒性濃度TC50的測定（±s）

表2 半數(shù)毒性濃度TC50的測定（±s）

TC50青蒿素 1.77mmol/L藥物濃度20mmol/L OD490 細胞抑制率/%0.24±0.03 96.23 10 0.28±0.13 88.68 5.0 0.39±0.08 67.94 2.5 0.45±0.21 56.60 1.25 0.52±0.04 43.30 0.625 0.58±0.17 32.08 0.312 0.67±0.09 15.09 0.156 0.73±0.24 -雙氫青蒿素 500μmol/L 0.20±0.05 100.00 58.24μmol/L 250 0.28±0.15 88.68 125 0.36±0.07 73.58 62.5 0.48±0.02 50.94 31.2 0.53±0.11 41.51 15.6 0.62±0.06 20.75 7.8 0.68±0.10 13.21 2.9 0.72±0.10 5.66青蒿琥酯 500μmol/L 0.15±0.05 100.00 64.33μmol/L 250 0.26±0.03 92.45 125 0.37±0.20 71.70 62.5 0.49±0.05 49.06 31.2 0.57±0.03 33.96 15.6 0.66±0.14 16.98 7.8 0.70±0.10 9.43 2.9 0.74±0.03 -5-Fu 20mmol/L 0.13±0.08 100.00 1.18mmol/L 5.0 0.27±0.17 90.57 1.25 0.48±0.07 50.94 0.31 0.62±0.06 24.53 0.078 0.69±0.10 11.32正常細胞對照 0.75±0.24 1%DMSO對照0.22±0.18

本實驗初步顯示，青蒿素各衍生物的抗肺癌A549細胞的活性不相同。其中雙氫青蒿素和青蒿琥酯抗A549活性較好，青蒿素作用稍差。實驗中雙氫青蒿素和青蒿琥酯都能延長細胞增殖時間，延緩細胞增殖周期，這與之前報道的青蒿素類藥物可以將細胞周期阻滯于G2/M期的結(jié)果一致[8]。而青蒿素對A549的抑制作用并不明顯。基于不同的青蒿素衍生物對同一腫瘤的抑制活性并不相同這一現(xiàn)象，這可能與化學藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙氫青蒿素為青蒿素經(jīng)四硼酸鈉還原所得，而青蒿琥酯的代謝產(chǎn)物是雙氫青蒿素，各衍生物的極性不同，或許會導致細胞對其攝取或結(jié)合的程度也不相同，從而影響藥物抗腫瘤活性。同時與體內(nèi)篩選系統(tǒng)相比，體外抗腫瘤篩選體系缺乏氧化還原代謝酶系統(tǒng)完整性，這也對前體藥抗腫瘤活性的研究有一定的影響。

[1]廖洪利，蘇春麗，王偉新，等.抗腫瘤青蒿素衍生物的研究[J]. 藥學實踐雜志，2009，27（2）：84-86.

[2]賀小青，方鵬飛.青蒿素及其衍生物的藥理作用[J].醫(yī)藥導報，2006，25（6）：528-530.

[3]李秀萍，郭偉，何琳.青蒿素及其衍生物的藥用研究進展[J].疾病監(jiān)測與控制雜志，2006，2（7）：449-450.

[4]梅林，石開云，蘇建華，等.青蒿素國內(nèi)研究進展[J].激光雜志，2008，29（2）：95-96.

[5]張豪，沈明山，方宏清，等.轉(zhuǎn)鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導的藥物運輸[J].中國生物工程雜志，2004，24：1-5.

[6]王勤，吳理茂，王乃平，等.青蒿琥酯抗腫瘤作用的機制研究[J].藥學學報，2002，37（6）:477.

[7]聶蕾，殷隆，尹少甫，等.青蒿琥酯誘導人早幼粒白血病細胞HL-60凋亡的線粒體機制[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10（2）:176-179.

[8]林芳，錢之玉，丁健，等.二氫青蒿素對人乳腺癌MCF-27細胞的體外抑制作用[J].中國新藥雜志，2002，11（12）：934.