羊棲菜巖藻黃質色素的抗氧化性研究

汪財生，王 璐，劉麗平，李彩燕，錢國英 ，楊義右

(浙江萬里學院生物與環境學院，浙江寧波315100)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)屬于褐藻門馬尾藻科，在我國廣東、福建、浙江等地海域均有分布，其中含有多種抗腫瘤和改善人體免疫的活性成分，對高血壓、大腸癌等均有一定療效，具有較高的營養和藥用價值［1-2］。巖藻黃質(fucoxanthin)又稱巖藻黃素、褐藻黃素，具有共軛雙鍵，且含有丙二烯和環氧烷結構，屬類胡蘿卜素類色素［3］，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動植物中［4-5］。國外曾報道巖藻黃質可以抑制視黃醇缺陷引起的氧化壓力，且其抑制效果強于β-胡蘿卜素［6］。因此，羊棲菜中提取的巖藻黃質類色素產品可能具有清除自由基及抗氧化等功能活性。本文從還原力、抗脂質過氧化功能進行評價，并在清除DPPH·基礎上，采用熒光化學發光法進一步研究羊棲菜巖藻黃質類色素粗品對活性氧自由基的清除能力，為其深度研究及開發應用提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

羊棲菜 購于浙江溫州洞頭縣，5～6 月新鮮藻體，清水沖洗藻體表面泥沙、鹽粒，瀝干后于-20℃冰柜中儲藏，實驗前取冰凍藻體真空冷凍干燥，粉碎過60 目篩于-20℃冰箱中避光密封保存備用;巖藻黃質標準品 Sigma，≥99%;H2O2上海哈勃，≥30%;魯米諾 南京探求，≥98%;BHT 德國拜耳，99.8%;VC、VESigma，≥98%;DPPH Sigma，≥95%。

SFE-2 超臨界CO2萃取儀 美國ASI;ALPHA1-4/2-4LSC 冷凍干燥機 德國Christ;Cary50 紫外分光光度計 美國Varian;BC-027-TY6876 化學發光檢測儀 美國Beckman。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊棲菜巖藻黃質類色素粗品的制備 稱取一定質量的羊棲菜干粉，參考Myong-Kyun Roh 等［7］報道的超臨界CO2提取裙帶菜中巖藻黃質方法改進，于提取壓力30MPa、溫度50℃的條件下超臨界CO2萃取1.5h，冷凍干燥得紅褐色巖藻黃質粗品固體粉末，置于紅棕色樣品瓶-18℃保存備用。參考尹尚軍等［8］的方法，HPLC 測定色素干粉中巖藻黃質含量7.36%。

1.2.2 還原力的測定 參考張福娣報道的方法［9］并略作調整，取一定濃度的待測液0.5mL，加0.2mol/L、pH6.6 的磷酸鹽(PBS)緩沖液和1% 的K3Fe(CN)6溶液各1.25mL，混勻，將混合液50℃保溫20min 后，加10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混勻，1500r/min 離心10min。取上清液2.5mL，加2.5mL 蒸餾水及0.1%的FeCl31mL，混勻，10min 后檢測OD700nm值。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質粗品、VC、VE，進行還原能力評價。

1.2.3 DPPH 法測定清除自由基能力 參考文獻［10-11］，精確稱取40mg 的DPPH·，用無水乙醇溶解、定容至500mL，配成2 ×10-4mol/L 的DPPH·溶液，置于棕色瓶備用。取DPPH·溶液2mL 加入到2mL 一定濃度的待測液中，充分混勻。室溫靜置30min 后檢測OD517nm值。樣品DPPH·的清除率可由公式(1)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質粗品、VC、VE，進行DPPH 清除率評價。

式中，Ae=2mL DPPH·溶液+2mL 無水乙醇的OD517nm值;Ai=30min 反應后2mL DPPH·溶液+2mL待測溶液的OD517nm值;Aj=30min 反應后2mL 無水乙醇+2mL 待測溶液的OD517nm值。

1.2.4 羥自由基清除能力測定 實驗用魯米諾化學發光法測定Fenton 反應產生·OH 的清除能力，按文獻［12］方法，調整H2O2量，化學發光儀中快速啟動發光反應，記錄每間隔2s 發光強度值，至出現峰值，共180s 積分峰值CP1，同時用甲醇做空白對照，其發光強度積分峰值記為CP0，則·OH 的清除率由公式(2)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000μg/mL 巖藻黃質粗品、VC、VE，進行·OH清除率評價。

式中，CP0-甲醇的空白發光積分值;CP1-待測液的發光積分值。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除能力測定 參考文獻［12］，以化學發光法分別測定100、200、400、800、1000μg/mL 不同濃度的巖藻黃質粗品、VC、VE對非酶體系堿性連苯三酚產生的O-2·的清除能力。在反應池中加50μL 的5mmol/L 的魯米諾溶液和不同濃度待測液50μL，充分混勻，再加100μL 的6mmol/L 的連苯三酚溶液，快速于發光儀中啟動反應，每2s 測定一次發光強度，至出現峰值，積分值CP1。同時用甲醇作空白對照，其發光強度積分值記作CP0，則O2-·的清除率由公式(3)計算:

式中，CP0-甲醇的空白發光積分值;CP1-待測液的發光積分值。

1.2.6 過氧化氫清除能力的測定 參考呂曉玲等［12］報道的方法，用魯米諾化學發光法，在反應池中加50μL 待測液，1mol/L 魯米諾溶液50μL，pH9.5 的碳酸緩沖液100μL，充分搖勻后，加體積分數0.15%的H2O2溶液50μL，開啟反應，每2s 測定一次發光強度，至出現峰值，積分值CP1，以甲醇作為空白對照，其發光強度積分值記作CP0，則H2O2的清除率由公式(4)計算。實驗分別配制不同濃度的100、200、400、800、1000 μg/mL 巖藻黃質粗品、VC、VE，進行H2O2清除率評價。

式中，CP0-甲醇的空白發光積分值;CP1-待測液的發光積分值。

1.2.7 抗脂質過氧化功能的測定 參考鄧勝國等［11］報道的方法略作調整，用亞油酸加速氧化法測定巖藻黃質粗品的抗脂質過氧化功能。將不同濃度的待測液0.2mL 分別加至具塞試管中，再加2.5%的亞油酸1mL 和0.05mol/L 的PBS 緩沖液(pH7)0.8mL，置于45℃恒溫培養箱中，空白對照用0.2mL 無水甲醇代替待測液。每隔24h 取45℃恒溫培養液0.05mL，加75%甲醇4.85mL 和30%硫氰酸銨0.05mL，再加3.5%HCl 配制的0.02mol/L 的FeCl2溶液0.05mL，反應3min，用分光光度計測定OD500nm值，考察亞油酸過氧化物生成量。

1.2.8 數據處理 實驗數據均采用Excel 進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 羊棲菜巖藻黃質類色素粗品還原能力

還原性是一種物質抗氧化能力的一個重要指標，也是物質抗氧化機理之一。一般情況下樣品的還原能力與抗氧化活性之間呈顯著的相關性［13］，即反應后吸光值的大小直接反映還原力強弱，吸光值越大，抗氧化活性越強。羊棲菜巖藻黃質粗品與對照品VC、VE還原能力如圖1 所示，均表現為與樣品濃度呈正相關，相關系數R2分別為0.991、0.986、0.998。VC、VE還原能力較強，隨樣品濃度增加而呈增強趨勢明顯，而巖藻黃質粗品表現為最低，且增加樣品濃度還原能力增強緩慢。原因可能是還原體系的酸及溫度條件影響巖藻黃質粗品的穩定性，還原能力不明顯。

2.2 清除DPPH·能力

圖1 VC、VE、巖藻黃質粗品的還原能力(sd)Fig.1 Reducing power of VC，VE and fucoxanthin

按照1.2.3 的方法測定巖藻黃質粗品、VE、VC對DPPH·的清除率，結果如圖2 所示，在100～1000μg/mL實驗濃度范圍內，巖藻黃質粗品、VE、VC對DPPH·的清除率均隨著濃度的增加而增大，均呈良好的劑量-效應的線性關系，其相關系數R2分別為0.994、0.993、0.915。VEDPPH·的IC50為267.314μg/mL，清除效果最好。VC次之，為357.068μg/mL。而巖藻黃質的DPPH·的IC50達到565.2μg/mL，為VE的211.4%;但濃度為1000μg/mL 時，巖藻黃質的DPPH·清除率達到88.79%，與同濃度VC清除率(90.07%)相當，僅低于VE8.25%;當濃度為200μg/mL 時，DPPH·清除率為21.61%，略高于楊立群［14］通過硅膠柱層析獲得的海帶巖藻黃質產品濃度為270μg/mL 時的19.85%。

圖2 巖藻黃質粗品、VE、VC 的DPPH 自由基清除能力(xˉ±sd)Fig.2 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on DPPH·

2.3 清除·OH 能力

巖藻黃質粗品、VC、VE對由Fenton 反應體系產生·OH 的清除效果如圖3 所示，三個樣品在濃度為100～1000μg/mL 時，對·OH 清除的效果表現良好的量效關系，其相關系數R2分別為0.971、0.967、0.982。樣品對·OH 的IC50分別為386.29、650.28、253.35μg/mL，當受試濃度至1000μg/mL 時，其·OH 清除率分別為81.22%、65.33%、93.21%，表明該巖藻黃質粗品清除·OH 作用僅次于VE，遠強于VC，具有較好地·OH清除效果。因此，選用天然巖藻黃質粗品制成保健品等，具有防衰老、預防疾病的重要意義。

2.4 清除O2- ·能力

清除O2-·能力結果如圖4 所示。在濃度為100～1000μg/mL 范圍內，巖藻黃質粗品、VE、VC對由堿性連苯三酚體系產生的O2-·清除效果均隨其質量濃度的增加而增強，相關系數R2分別為0.900、0.959、0.960，具有良好的量效關系;各樣品O2-·清除率的IC50分別為615.71、469.45、355.27μg/mL，即對O2-·清除率作用大小是VC＞VE＞巖藻黃質粗品。當濃度達1000μg/mL 時，巖藻黃質粗品、VC、VE對O2-·的清除率相當接近，分別為83.98%、87.75%、85.54%，即巖藻黃質粗品的O2-·的清除率略低于VC與VE。而嚴小軍等［15］采用硅膠柱層析純化獲得的鼠尾藻巖藻黃質產品濃度為10μg/mL 時，O2-·清除率為7.9% ±0.4%，高于VE的6.9% ±2.6%。推測由于巖藻黃質產品純度及不同藻類來源的區別所致。

圖3 巖藻黃質粗品、VC、VE 的·OH 清除能力(sd)Fig.3 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and VE on·OH

圖4 巖藻黃質、VE、VC 的O -2 ·清除能力(sd)Fig.4 Scavenging activities of fucoxanthin，VE and VC on O -2 ·

2.5 H2O2 清除能力

按照1.2.6 方法測定巖藻黃質粗品對H2O2的清除率，結果如圖5 所示。樣品在濃度為100～1000μg/mL范圍內，也具有良好的量效關系，隨樣品濃度增加H2O2的清除率增強，巖藻黃質粗品、VE、VC的相關系數R2分別為0.898、0.955、0.921。巖藻黃質粗品對H2O2的IC50為658.74μg/mL，清除能力小于VC、VE，但對H2O2清除作用在受試濃度范圍內效果明顯，清除率由14.86%增大到71.51%。實驗表明巖藻黃質粗品及標準對照品VC、VE都可作為H2O2清除劑。

圖5 巖藻黃質、VC、VE 的H2O2 清除能力(sd)Fig.5 Scavenging activities of fucoxanthin，VC and Ve on H2O2

2.6 抗脂質過氧化功能

如圖6 所示，亞油酸在45℃條件下保溫時，過氧化作用十分顯著，加入抗指質氧化劑巖藻黃質粗品、BHT、VC后，過氧化作用能明顯受到抑制，均隨著樣品濃度的增加，其抗脂質過氧化作用增強，并在實驗期內表現穩定。巖藻黃質粗品受試各濃度及實驗期內的吸光值均小于400μg/mL VC的吸光值，表明巖藻黃質粗品的抗脂質過氧化作用遠遠強于VC。但巖藻黃質粗品總體對脂質氧化的抑制約為BHT 的50%。實驗濃度范圍內抗脂質過氧化功能的強弱順序依次為BHT、巖藻黃質粗品、VC。實驗表明巖藻黃質粗品具有較強的抗脂質過氧化功能，是一種優良的天然抗氧化劑。

圖6 巖藻黃質、VC、BHT 對脂質過氧化的抑制能力(sd)Fig.6 Restraint activities of fucoxanthin，VC and BHT on lipid peroxidation

3 結論

超臨界CO2提取的羊棲菜巖藻黃質色素產品屬于天然類胡蘿卜素，體外抗氧化實驗表明，在被試濃度范圍內的還原能力表現不強，但對DPPH·、·OH、O2-·等自由基及H2O2均表現出較強的清除能力，其中對·OH 的清除能力高于對照品VC，IC50為386.29ug/mL，遠低于VC的650.28ug/mL;對O2-·的清除能力與VC相當。此外，巖藻黃質粗品的抗脂質過氧化功能明顯強于VC。因此，羊棲菜中巖藻黃質粗產品是一種具有良好抗氧化功能的天然食用色素，可用于食品的著色、防止許多由體內脂質過氧化和自由基損傷引起的疾病，起到一定的保健作用。本研究使用的是羊棲菜巖藻黃質色素粗品，成分比較復雜，主要包括巖藻黃質、巖藻黃醇、脂類等物質，可通過進一步純化提高羊棲菜巖藻黃質純度，有望成為一種天然的新型高效抗氧化劑成分在食品、化妝品及保健品上得到開發利用。

［1］季宇彬.海洋湖沼藥物藥理與應用［M］.哈爾濱:黑龍江科學技術出版社，2003:10.

［2］張展，劉建國，劉吉東.羊棲菜的研究述評［J］.海洋水產研究，2002，23(3):67-74.

［3］汪曙暉，薛長湖.巖藻黃素的結構、性質和功能［J］.食品工業科技，2010，31(6):408-410.

［4］項斌，高建榮.天然色素［M］.北京:化學工業出版社，2004:8.

［5］陳國棟，燕燕，宋晶.巖藻黃素的生物活性及應用研究進展［J］.河北漁業，2009(8):50-52.

［6］Sangeetha R K，Bhaskar N，Baskaran V.Comparative effects of β - carotene and fucoxanthin on retinol deficiency induced oxidative stress in rats［J］.Mol Cell Biochem，2009，331:59-67.

［7］Myong- Kyun Roh，Md Salim Uddin，Byung- Soo Chun.Extraction of fucoxanthin and polyphenol from undaria pinnatifida using supercritical carbon dioxide with co - solvent［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2008(13):724-729.

［8］尹尚軍，徐濤，劉麗平，等.羊棲菜巖藻黃質的提取工藝研究［J］.食品工業科技，2011，32(4):272-275.

［9］張福娣，游紀萍，陳新香，等.扶?；ㄉ氐目寡趸饔醚芯浚跩］.中國食品學報，2010，10(6):72-76.

［10］董彩軍，謝明勇，聶少平，等.青錢柳提取物體外抗氧化活性研究［J］.食品科學，2007，28(10):31-34.

［11］鄧勝國，鄧澤元，黃麗.荷葉黃酮體外抗氧化活性的研究［J］.食品科技，2006(7):274-276.

［12］呂曉玲，劉楠.黑胡蘿卜色素精制工藝及其體外抗氧化性的研究［J］.食品研究與開發，2008，29(12):74-78.

［13］Duh P D，Yen G C.Antioxidative activities of three herbal water extracts［J］.Food Chem，1997，60:639-645.

［14］楊立群.海帶中總色素和褐藻黃素的提取分離及其生物活性研究［D］.濟南:山東師范大學，2008.

［15］嚴小軍，范曉，婁清香，等.海藻中類胡蘿卜素抗超氧自由基活性研究［J］.海洋科學集刊，2001，43:115-119.