抗IBDV－IBV二聯卵黃抗體的制備與應用

曾祥偉，徐亞萍，李志軍，李夢溪

（東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

雞傳染性囊病是由傳染性囊病病毒（IBDV）引起的幼雞的一種急性、高度接觸性傳染病。傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引發的雞的一種急性、高接觸性的呼吸道和泌尿生殖道疾病。這兩種病毒性疾病一直是危害世界養禽業的重要傳染病，主要依靠接種疫苗進行防控。然而，隨著這兩種病毒的不斷變異，疫苗接種也不能達到理想的保護效果。近兩年來，黑龍江地區的一些養殖場多次發生了IBDV和IBV混合感染，導致大批幼齡雞只發病死亡，造成巨大的經濟損失。鑒于此，本試驗將從當地分離的這兩種疫病流行毒株制作成油佐劑滅活疫苗，對剛開產的蛋雞進行多次加強免疫，制備抗IBDV－IBV二聯高免卵黃抗體，嘗試對當地發生的疫情進行有效控制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 30只20周齡健康的海賽克斯蛋雞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗牧場提供，它們均經過了IBD、IB的常規基礎免疫。

1.2 主要試劑 IBD瓊擴標準抗原、IBD瓊擴標準陽性血清，雞傳染性支氣管炎凝集抗原與標準陽性血清，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。Span白油、甲醛、氯仿等，購自哈爾濱聯星生物公司。

1.3 IBD、IB油佐劑滅活疫苗 現場采集的已確診為IBD的典型病雞的新鮮腔上囊，與生理鹽水按1∶5比例勻漿，反復凍融3次，3000r／min離心30 min，取上清用甲醛滅活，并配以油佐劑制成滅活苗。將從當地養殖場分離的IBV接種10日齡雞胚尿囊腔，37℃培養36～40h，收集尿囊液，經甲醛滅活后加油佐劑，制成油乳劑滅活苗。

1.4 免疫方法 用制備好的IBD油乳劑滅活苗和IB油乳劑滅活疫苗對試驗雞進行分別肌肉注射，每種疫苗的接種劑量為2mL／只，每間隔10d，以油乳劑滅活苗分別做3次加強免疫，劑量同上。此后定期檢測卵黃抗體的水平，待抗IBDV瓊擴效價達1∶128以上，抗IBV的Hl效價達1∶1024以上時開始收集高免蛋，4℃儲存備用。瓊擴效價降低到1∶64，Hl效價降低到1∶512時停止收蛋，再進行加強免疫。

1.5 卵黃抗體的制備 收集的高免蛋先用自來水將蛋表面沖洗干凈，再放入0.5%新潔爾滅溶液中浸泡消毒，然后取出用酒精棉擦拭蛋殼，打開蛋殼，無菌分離蛋黃，加入滅菌生理鹽水做適量稀釋。再以氯仿為溶劑與卵黃生理鹽水等量混合，室溫下放置6h以上，期間振蕩2～4次，使其充分溶解。2000r／min離心20min，收集上清。最后按每mL加入青霉素1000IU、鏈霉素1000μg，并按總量的0.01%加入硫柳汞防腐，經雙層滅菌紗布過濾，即為制備的卵黃抗體。

1.6 無菌檢驗和安全檢驗 取高免卵黃抗體0.2 mL，分別接種于鮮血瓊脂平板、馬丁肉湯和厭氣肉肝湯培養基，37℃培養48h，觀察有無細菌生長。用14日齡健康雛雞10只，各皮下注射本品10mL。觀察10d，記錄雛雞的健康和存活情況。

1.7 效價測定 取待檢卵黃抗體液，以瓊脂擴散法（AGP）檢測抗IBDV抗體效價；以血凝和血凝抑制試驗（HA－HI）檢測抗IBV抗體效價。

1.8 臨床應用試驗 哈爾濱市郊的某養禽場發生了疫情，死亡幼雞100多只，經臨床剖檢和實驗室診斷，結果為IBDV、IBV混合感染。選取出現發病癥狀的雞120只，隨機分成兩組。一組用制備的抗IBDV－IBV二聯卵黃抗體以肌肉注射進行治療，每天2次，連續治療1周；另一組按照以往的治療方法進行處理，病毒唑加抗生素肌肉注射，每天2次，連續治療1周。對沒有出現癥狀的雞同時注射該二聯卵黃抗體進行預防，每天1次，連續用3d。觀察并記錄雞只的健康狀況和存活情況。

2 結果

2.1 無菌檢驗和安全檢驗 制備的卵黃抗體接種3種培養基均無細菌生長；接種的10只雛雞健康狀況良好，未見任何不良反應。

2.2 卵黃抗體效價測定 經AGP法檢測抗IBDV抗體效價為1∶256，HA－HI法檢測抗IBV抗體效價為1∶1024，滿足生產中對抗體效價的要求。

2.3 臨床應用觀察 對于發病雞，應用卵黃抗體的效果要明顯高于常規病毒唑加抗生素的治療效果，具體結果見表1。沒有出現癥狀的雞注射卵黃抗體后，沒有1只出現感染癥狀，均十分健康，預防有效率達100%。

表1 卵黃抗體治療效果的測定

3 討論

卵黃抗體產量高，不受地域和時間的限制；生產成本較低，收集和提純方便，大規模提取抗體的技術已經成熟；因此被廣泛用于動物傳染病的緊急治療和預防中［1－2］。不論雞IBD的卵黃抗體還是IB的卵黃抗體的制備和應用都常有報道，而將兩者結合制備二聯抗體卻鮮有報道。本研究制備了抗IBDVIBV二聯卵黃抗體，主要是針對當地一些養殖場多次發生了IBDV和IBV混合感染的疫情而定的。從當地分離的病毒株制成滅活疫苗用于加強免疫，這樣獲得的高免卵黃抗體針對性更強，因此在當地疫情的預防和治療上取得了良好的效果。但是如果在其他地區應用，其預防和治療的有效性還有待驗證。

在臨床試驗中，注意到卵黃抗體治療組中死亡的7只雞主要是處在發病的晚期或者有繼發感染，而處于發病早期的病雞全部恢復。這也驗證了一些學者的研究［3］，即證明卵黃抗體在發病的早期應用通常會收到良好效果，給疾病的中晚期應用效果則不明顯。因此，在實踐中，一定要注意卵黃抗體應用的時機，越早注射越能快速控制疫情發展。

［1］ 李文學，青學剛，劉剛.高免卵黃抗體應用研究現狀及發展趨勢［J］.安徽農業科學，2010，38（24）：12981－12982.

［2］ 崔桂清，李火舉.卵黃抗體在防治仔豬腹瀉上的應用［J］.中國獸醫雜志，2010，46（3）：61－63.

［3］ 張鐵，王春光.抗雞新城疫和傳染性法氏囊病高免卵黃抗體的正確應用［J］.四川畜牧獸醫，2002，29（2）：46.