小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響

盧德章，范宏剛，王洪斌，張欒松，馬 昆，姜 勝，譚麗娟，于世明

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

Na＋，K＋-ATP酶（又被稱(chēng)為鈉泵）普遍存在于各種細(xì)胞膜，只有保持此酶的正常活性，才能產(chǎn)生并維持可興奮細(xì)胞的膜電位，以維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性［1］。麻醉藥可通過(guò)對(duì)Na＋，K＋-ATP酶活性的抑制，改變細(xì)胞膜內(nèi)外Na＋，K＋、Ca2＋穩(wěn)態(tài)，影響突觸興奮、突觸傳遞和突觸的遞質(zhì)釋放而產(chǎn)生麻醉作用。小型豬復(fù)合麻醉劑-XFM，是依據(jù)平衡麻醉理論和小型豬的生理特點(diǎn)研制成功的一種小型豬專(zhuān)用的麻醉劑［2］。為了更好的將XFM在臨床上推廣應(yīng)用，保障科研試驗(yàn)后小型豬生理機(jī)能快速恢復(fù)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小型豬麻醉課題組在XFM的基礎(chǔ)上，研制小型豬特異性麻醉頡頏劑，來(lái)頡頏XFM的麻醉作用。本研究旨在探討大鼠在XFM麻醉下被小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒時(shí)大腦各腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶的變化，擬從離子ATP酶方面揭示小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒作用的分子學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 XFM和小型豬特異性麻醉頡頏劑由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院外科教研室配制，超微量Na＋-K＋-ATP酶測(cè)定試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠144只，雌雄各半，體重210g±20g，黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法及動(dòng)物分組 所有的大鼠腹腔注射XFM 0.05mL／10g進(jìn)行麻醉，然后再隨機(jī)取72只為生理鹽水組，其余為試驗(yàn)組，且生理鹽水組和試驗(yàn)組又分為早期、中期和晚期催醒組。大鼠分別于注射XFM 后10、30、60min再腹腔注射0.05mL／10 g小型豬特異性麻醉頡頏劑或0.05mL／10g生理鹽水。大鼠分別于翻正反射恢復(fù)期（催醒Ⅰ組或?qū)φ闸窠M）及可直線爬行時(shí)（催醒Ⅱ組或?qū)φ闸蚪M）各剖殺取材。在生理鹽水冰面上取腦，用4℃生理鹽水將腦上的血跡沖洗干凈，迅速分離雙側(cè)大腦皮層、海馬、小腦、腦干、丘腦，立即液氮冷凍。

從液氮罐中將不同腦區(qū)的腦組織取出，稱(chēng)重后按1∶9（W／V）置入預(yù)冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后按差速離心法分離不同腦區(qū)腦突觸體。首先1000r／min離心10min，收集上清液，沉淀用生理鹽水溶液混懸后再按上述方法離心，收集上清液，合并兩次上清液，然后以17000r／min離心55min，棄去上清液，即獲粗制突觸體。用相同緩沖液調(diào)成2g／L的粗制突觸體混懸液，待測(cè)ATP酶活性。所有操作均在4℃下進(jìn)行。采用比色法測(cè)定Na＋，K＋-ATP酶活性。酶活力以每小時(shí)分解每毫克組織蛋白產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷的含量（μmol／mg·h）表示。按考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠行為學(xué)變化 注射小型豬特異性麻醉頡頏劑后，各試驗(yàn)組的大鼠均表現(xiàn)出呼吸加快、搖頭和排尿等現(xiàn)象，給予一定的刺激后大鼠可出現(xiàn)體動(dòng)，隨后開(kāi)始四肢抖動(dòng)，然后恢復(fù)翻正反射。翻正恢復(fù)后，大鼠可以進(jìn)行斜線爬行或轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，最后大鼠可進(jìn)行直線爬行。注射小型豬特異性麻醉頡頏劑可以明顯的縮短大鼠的翻正反射恢復(fù)時(shí)間和直線爬行恢復(fù)時(shí)間，與對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠行為學(xué)變化情況（min±SD）

表1 小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠行為學(xué)變化情況（min±SD）

注：①組方內(nèi)數(shù)據(jù)比較：＊＊代表與0min比較P＜0.01，差異極顯著；＊代表與0min比較P＜0.05，差異顯著。②同一時(shí)間點(diǎn)組方間數(shù)據(jù)比較：肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）；大寫(xiě)不同表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同且大小寫(xiě)也相同表示差異不顯著（P＞0.05）。下表同

翻正反射恢復(fù)時(shí)間 直線爬行恢復(fù)時(shí)間早期 對(duì)照組69.83±7.56 73.31±12.33催醒組 試驗(yàn)組 5.68±1.17＊＊Aa 8.19±1.99＊＊Aa中期 對(duì)照組45.54±11.53 49.78±13.32催醒組 試驗(yàn)組 5.71±1.82＊＊Aa 8.47±2.85＊＊Aa晚期 對(duì)照組20.87±5.46 24.60±6.56催醒組 試驗(yàn)組 5.31±0.59＊＊Aa 8.38±1.34＊＊Aa

2.2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 早期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了57.89%（P＜0.01）、60.34%（P＜0.01）、75.23%（P＜0.01）、42.98%（P＜0.01）和33.06%（P＜0.01）。催醒Ⅰ組腦干較對(duì)照Ⅰ組增加了26.53%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干分別較對(duì)照Ⅱ組增加了22.45%（P＜0.01）、14.81%（P＜0.01）、38.41%（P＜0.01）、35.16%（P＜0.01）和25.00%（P＜0.01）。

中期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦和小腦的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了83.81%（P＜0.01）、48.00%（P＜0.01）、45.74%（P＜0.01）和38.83%（P＜0.01）。催醒Ⅰ組海馬和小腦分別較對(duì)照Ⅰ組降低12.59（P＜0.01）和18.25%（P＜0.01）；而丘腦和腦干分別較對(duì)照Ⅰ組升高了8.40%（P＜0.01）和16.50%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬和丘腦相比對(duì)照Ⅱ組高了27.81%（P＜0.01）、8.19%（P＜0.01）和33.33%（P＜0.01）。

晚期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了88.89%（P＜0.01）、59.50%（P＜0.01）、33.57%（P＜0.01）、10.11%（P＜0.01）和41.07%（P＜0.01）。丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性在催醒Ⅰ組分別較對(duì)照Ⅰ組增加13.82（P＜0.01）、42.40%（P＜0.01）和13.13%（P＜0.05）；而大腦皮層和海馬的催醒Ⅰ組分別較對(duì)照Ⅰ組減少15.38%（P＜0.01）和15.97%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干分別較對(duì)照Ⅱ組25.50% （P＜0.01）、15.57% （P＜0.01）、37.50%（P＜0.01）、47.37%（P＜0.01）和12.86%（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 （μmol／mg·h）

表2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對(duì)大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 （μmol／mg·h）

大腦皮層 海馬 丘腦 小腦 腦干早期催醒組對(duì)照Ⅰ組 1.13±0.08DEcd 1.49±0.05Ccd 1.20±0.04Ecd 1.18±0.09Gf 0.98±0.07Gf對(duì)照Ⅱ組 1.47±0.09Cb 1.62±0.09Bbc 1.38±0.04Bb 1.28±0.08DEFdef 1.32±0.09BCbcd催醒Ⅰ組 1.14±0.05DEcd 1.16±0.06De 1.09±0.05Fd 1.21±0.04FGef 1.24±0.06CDcde催醒Ⅱ組 1.80±0.07Ba 1.86±0.06Aa 1.91±0.06Aa 1.73±0.06Bb 1.65±0.07Aa中期催醒組對(duì)照Ⅰ組 1.11±0.02DEcd 1.43±0.07Cd 1.19±0.06Ecd 1.26±0.03EFGdef 1.03±0.02FGf對(duì)照Ⅱ組 1.51±0.03Cb 1.71±0.03Bb 1.41±0.02Bb 1.36±0.02CDcd 1.35±0.09Bbc催醒Ⅰ組 1.05±0.04EFcd 1.25±0.03De 1.29±0.05CDbc 1.03±0.03Hg 1.20±0.05DEde催醒Ⅱ組 1.93±0.04Aa 1.85±0.03Aa 1.88±0.05Aa 1.43±0.03Cc 1.22±0.05CDEcde晚期催醒組對(duì)照Ⅰ組 1.17±0.03Dc 1.44±0.08Cd 1.23±0.02DEc 1.25±0.03EFGdef 0.99±0.05Gf對(duì)照Ⅱ組 1.49±0.08Cb 1.67±0.07Bb 1.36±0.07BCb 1.33±0.03DEcde 1.40±0.03Bb催醒Ⅰ組 0.99±0.03Fd 1.21±0.04De 1.40±0.03Bb 1.78±0.02Bb 1.12±0.02EFef催醒Ⅱ組 1.87±0.06ABa 1.93±0.06Aa 1.87±0.07Aa 1.96±0.06Aa 1.58±0.05Aa

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)分布有較高的Na＋，K＋-ATP酶，對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)性、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信息傳遞有重要作用，因此Na＋，K＋-ATP酶活性的降低必然影響突觸的化學(xué)傳遞作用及神經(jīng)的傳導(dǎo)功能［3］。

有研究發(fā)現(xiàn)，XFM的全麻作用與抑制特定腦區(qū)突觸體Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。大腦皮質(zhì)、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶可能是XFM全麻作用的靶位之一［4］。在本試驗(yàn)中，早、中、晚期催醒的催醒Ⅰ組海馬和催醒Ⅱ組大腦皮層的Na＋，K＋-ATP酶活性均表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，即Na＋，K＋-ATP酶的活性在早期催醒時(shí)最低，在中期催醒時(shí)最高，且Na＋，K＋-ATP酶活性的這種變化趨勢(shì)與大鼠行為學(xué)的變化相一致。分析試驗(yàn)結(jié)果，推斷大腦皮質(zhì)和海馬的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用的靶位之一，且小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用可能與增加這兩個(gè)腦區(qū)的Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。

海馬的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢復(fù)翻正反射時(shí)發(fā)揮主要作用，這是因?yàn)楹ｑR是中樞神經(jīng)邊緣系統(tǒng)的一部分，在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于古皮層，由三層神經(jīng)元構(gòu)成，其中顆粒細(xì)胞或錐體細(xì)胞是投射神經(jīng)元，它們之間構(gòu)成的三突觸通路是研究藥物對(duì)突觸信號(hào)傳遞和神經(jīng)元電活動(dòng)影響的經(jīng)典途徑［5-6］。因此，小型豬特異性麻醉頡頏劑增加海馬的Na＋，K＋-ATP酶才會(huì)促使大鼠恢復(fù)翻正反射。在我們的研究中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，大腦皮層的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢復(fù)直線爬行時(shí)發(fā)揮主要作用。大腦皮層含有大量的與運(yùn)動(dòng)有關(guān)的神經(jīng)元，在意識(shí)和感覺(jué)的調(diào)控中起著重要的作用［7］。小型豬特異性麻醉頡頏劑通過(guò)增加Na＋，K＋-ATP酶的活性，激活大腦皮層上的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

然而，研究小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒機(jī)理是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子通道等方面內(nèi)容。研究Na＋，K＋-ATP酶活性只是在跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)某一方面揭示小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒機(jī)理，其必然還有更為復(fù)雜的分子機(jī)理不為我們所知，這需要進(jìn)行更為深入和全面的研究。

4 結(jié)語(yǔ)

大腦皮質(zhì)和海馬突觸體的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用的靶位之一，且小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用可能與增加這兩個(gè)腦區(qū)的Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。

［1］Villa R F，F(xiàn)errari F，Gorini A.Effect of in vivo L-acetylcarnitine administration on ATP-ases enzyme systems of synaptic plasma membranes from rat cerebral cortex［J］.Neurochem Res，2011，36（8）：1372-1382.

［2］盧德章，范宏剛，于世明，等.XFM對(duì)小型豬血流動(dòng)力學(xué)及內(nèi)皮源性血管活性物質(zhì)的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，31（1）：85-89.

［3］Peng C，Zheng T，Yang F，et al.Study of neurotoxic effects and underlying mechanisms of aconitine on cerebral cortex neuron cells［J］.Arch Pharm Res，2009，32（11）：1533-1543.

［4］范宏剛，王洪斌，盧德章，等.替來(lái)他明對(duì)大鼠不同腦區(qū)突觸體Na＋K＋-ATP酶活性的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（5）：83-85.

［5］Mychasiuk R，Gibb R，Kolb B.Prenatal stress alters dendritic morphology and synaptic connectivity in the prefrontal cortex and hippocampus of developing offspring［J］.Synapse，2012，66（4）：308-314.

［6］Pan Z，Lu X F，Shao C，et al.The effects of sevoflurane anesthesia on rat hippocampus：agenomic expression analysis［J］.Brain Res，2011，1381：124-133.

［7］Ruiz-Mejias M，Ciria-Suarez L，Mattia M，et al.Slow and fast rhythms generated in the cerebral cortex of the anesthetized mouse［J］.J Neurophysiol，2011，106（6）：2910-2921.