亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸檢測標準物質的制備研究

吳亞瓊，高志強，吳延功，張鶴曉，喬彩霞，張利峰，單 虎，尹燕博，朱淑芬，王慧珊

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026；3.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266034；4.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

口蹄疫是口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性的偶蹄動物共患傳染病，導致幼畜死亡，成年動物生產性能下降［1］。根據Christianson等報道，該病流行范圍廣，暴發后很難控制和消滅，至今仍沒有較好的防治方法，使國際社會畜牧業貿易損失慘重［2-3］。

目前國內進出口檢疫經常采用常規RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR來檢測口蹄疫病毒，其中5′NCR和2B區域的核酸序列在7個型間最為保守，為口蹄疫病毒通用性核酸檢測方法的靶區域，而1D區域為分型核酸檢測方法的靶區域［4-5］。本研究參考相關項目標準物質的研制方法［6］，針對目前口蹄疫病毒核酸擴增檢測缺乏標準物質的現狀，以口蹄疫病毒亞洲1型核酸為模板，分別對以上具有檢測意義的片段進行RNA標準物質的研究，并由多家實驗室運用共同定量的方法對標準物質進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 ROCHE公司的LightCycler 2.0，Roche 480熒光PCR儀，ABI7900HT熒光PCR儀。

1.2 試劑 RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-SP6試劑盒，Taq DNA聚合酶，限制性內切酶Bam HⅠ，購自Promega公司；DNA快速純化回收試劑盒，質粒快速提取純化試劑盒，購自TaKaRa公司，Trizol，購自Invitrogen公司；其余所有常規試劑均為分析純。

1.3 病毒核酸 口蹄疫亞洲Ⅰ型As-1／PK-1／2005病毒核酸，北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.4 熒光定量RT-PCR引物探針 分別根據5′NCR和1D區域序列設計引物探針對標準品進行定量研究。引物探針序列見表1。

1.5 口蹄疫病毒As-1／PK-1／2005的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴增、克隆和序列分析 設計引物擴增As-1／PK-1／2005的2個基因片段。引物序列見表2。

表1 熒光RT-PCR引物探針序列

表2 擴增口蹄疫病毒As-1／PK-1／20051nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的引物名稱、序列

對擴增產物進行純化后，克隆入TaKaRa公司的pMD20-T載體，挑取出多個克隆依次進行PCR鑒定、酶切鑒定、測序，逐步篩選出正確的克隆。

1.6 SP6體外轉錄病毒RNA 對上述重組質粒序列進行分析，選用Bam HⅠ進行完全酶切，可以切出含SP6啟動子的先行化DNA片段。用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems-SP6試劑盒進行體外轉錄。產物中加入DNase除去其中的DNA模板后，然后用Trizol法重提RNA，將得到的RNA沉淀溶于1.0mL的無RNA酶的滅菌水中，分裝，20μL／管，凍存于-80℃下，即得到制備好的2種RNA片段。

1.7 標準品制備與初步定值 取制備的兩種體外轉錄RNA，用DEPC水分別作200倍稀釋，測定其260 nm和280nm的吸光度值（A260和A280），并通過計算其比值來衡量物質的純度。根據測序結果，利用DNAMAN（Version 6）得出單鏈模板的分子量（MW）。按照下面公式計算初步拷貝數［7］：拷貝數＝A260×40×200×微升數×10-9×6.02×1023次／MW

根據計算結果，對兩個片段分別應用稀釋液（Trizol∶水＝3∶1）稀釋至1×109copies／μL。將制備的兩種RNA進行等體積混合，然后進行分裝，100μL／管。

1.8 均勻性檢驗 隨機抽取10管標準品，應用表1引物探針在重復條件下在2次試驗中分別測試這10份RNA樣品，手動設置基線，獲取Ct值。結果數據用單因子方差分析進行統計處理。

1.9 穩定性檢驗 選擇1nt～2208nt片段作為目標進行穩定性檢驗。隨機抽取制備的標準品，在以下每種條件下放置10支：（1）室溫20℃～25℃，相對濕度20%～50%，14d取出進行測試。（2）冰箱冷藏溫度2℃～8℃，6個月取出進行測試。（3）-20℃，1年后取出進行測試。（4）對照，-80℃，長期放置。

對制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）計算其拷貝數，進一步系列稀釋制成一系列外標品。隨機抽取按上述條件處理后的標準品，應用建立的口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型熒光RT-PCR方法來間接測定重新提取的RNA的拷貝數。采用兩樣本均數顯著性檢驗-t檢驗進行統計分析。

1.10 標準品協作標定 采用委托8家外部實驗室協作標定的方法來對制備的標準品進行定值。分別對制備的pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）計算其拷貝數，進一步系列稀釋制成一系列外標品。應用建立的口蹄疫病毒通用熒光RT-PCR方法（針對5′NCR和2B）來間接測定標準品的拷貝數。

1.11 不確定度分析 通過對實際檢測過程進行分析，確定標準品的總不確定度，進行評定。

2 結果與分析

2.1 口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段的擴增、克隆和序列分析 采用表2的引物，成功擴增了口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型的1nt～2208nt片段和3012nt～5155nt片段，并克隆入pMD20-T載體，見圖1。分析序列選取XbaⅠ、Ecor lⅠ對1nt～2208nt片段和PstⅠ對3012nt～5155nt片段酶切鑒定正確，見圖2。

對正確的克隆進行測序，選取序列正確的克隆命名為 pMD20-T-FMDV（1nt～2208nt）、pMD20-T-FMDV（3012nt～5155nt）。

2.2 SP6體外轉錄病毒RNA 用Bam HⅠ酶切上述質粒，均能切出含SP6啟動子和目的DNA的片段。線性化后進行體外轉錄獲得大量的2種RNA片段，純化溶于1.0mL的無RNA酶的滅菌水中，分裝為20μL／管，共50管，凍存于-80℃中。

2.3 標準品制備與初步定值 制備的2種RNA進行200倍稀釋后，其A260和A280的比值均在1.9±0.1范圍內，表明RNA純度較高。初步計算，1nt～2208nt片段拷貝數為3.081×1011copies／μL；3012nt～5155nt片段拷貝數為1.274×1011copies／μL。分別稀釋至1×109拷貝數／μL進行等體積混合分裝，100μL／管，共800管，凍存于-80℃中。

2.4 均勻性檢驗結果 對隨機抽取10管標準品測試后數據分析見圖3，圖4和表3。

按F臨界值F0.05（9、10）＝3.14。計算的F值分別為2.99和1.45，該值＜F臨界值，這表明在0.05顯著性水平時，樣品中目的核酸片段含量是均勻的。樣品間變異系數CV%＝，分別為2.17%和2.03%，均小于5%。

2.5 穩定性檢驗結果 選擇1nt～2208nt片段作為目標進行穩定性檢驗。將檢測組與對照組（-80℃）數據分別作兩樣本均數顯著性檢驗-t檢驗進行統計分析，結果見表4，表明檢測組與對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 標準品均勻性試驗方差分析結果

2.6 標準物質協作標定結果 采用委托8家外部實驗室協作標定的方法來對制備的標準品進行定值。經統計分析，取平均值作為定值結果，結果見表5。

2.7 不確定度分析 標準品的總不確定度包括：分析測定誤差、RNA提取過程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。根據我國對于標準物質管理法規［8］定值結果表示方法，可以通過A類評定方法［9］進行評定。協作標定的標準差涵蓋了以上不確定度分量。因此可作為本批標準品2個基因片段的不確定度（見表5）。

3 結語與討論

目前市場上有許多口蹄疫病毒核酸檢測試劑，但缺乏評價和驗證。根據文獻，5′NCR、2B和1D區域為目前常用口蹄疫病毒核酸檢測方法的檢測區域。因此，選用可以完全包含以上區域的1nt～2208nt和3012nt～5155nt2個片段來制備RNA標準物質。RNA極易降解，我們選擇商品化的RNA提取裂解液Trizol作為基質分散RNA，結果表明其均勻性及穩定性效果均很好。

多項結果分析表明，本研究制備的標準物質可以在實際生產中作為參比品應用于目前檢測方法的評價和驗證，對逆轉錄和PCR擴增2個方面進行質量控制，同時用來規范用于檢測的試劑和實驗室的質量，消除不同人員操作間的差異，為量值傳遞提供參比品，具有實用性和適用性。

表4 標準品t檢驗統計結果

表5 標準品協作標定結果

人醫的某些疾病中已應用我國自己的核酸檢測標準物質，使我國定量檢測缺乏統一標準，結果沒有可比性的現狀有了很大改進。而動物疾病標準物質的研究還趨于空白，造成檢測結果存在10～100倍的差異。因此，制備標準物質用于檢測方法的標準化已經是目前檢測動物疾病規范化的一個重要趨勢。

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