動物源腸桿菌分離株質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因的檢測

張 悅，王 楊，張美君，劉雅紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省獸藥研制與安全評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

隨著喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床中的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對其產(chǎn)生耐藥性的問題逐漸顯現(xiàn)出來。最初，人們認(rèn)為細(xì)菌對喹諾酮類的耐藥性應(yīng)該是由細(xì)菌染色體突變引起的，而不太可能存在耐藥性的水平轉(zhuǎn)移［1］。但近年的研究表明，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥性（PMQR）也是喹諾酮類耐藥機(jī)制的重要組成部分，雖然質(zhì)粒只能介導(dǎo)細(xì)菌對喹諾酮類的低水平耐藥，但是這種耐藥機(jī)制有助于細(xì)菌選擇其他的耐藥機(jī)制，從而導(dǎo)致高水平的耐藥。它包括3種主要機(jī)制：qnr機(jī)制，乙酰基轉(zhuǎn)移酶Aac（6′）-Ib-cr修飾喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制，以及對喹諾酮的主動外排機(jī)制。其中qnr機(jī)制為最早發(fā)現(xiàn)的PMQR機(jī)制，由于qnr基因可以編碼一種五肽重復(fù)片段蛋白，而這種蛋白可以保護(hù)DNA促旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶IV不受喹諾酮類藥物的作用，從而使細(xì)菌對喹諾酮類的敏感性下降［2］，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的qnr基因包括qnrA、qnrB、qnrS、qnrC和qnrD；氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac（6′）-Ib的變異體Aac（6′）-Ib-Cr所編碼的蛋白可以使含有未被取代的哌嗪基的喹諾酮類藥物哌嗪基乙酰化，增強(qiáng)細(xì)菌對喹諾酮類的耐藥性［3］；而質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類外排泵也可以使革蘭陰性菌對喹諾酮類的耐藥性增強(qiáng)，目前發(fā)現(xiàn)的此類基因有qepA［4］和oqxAB［5］。

腸桿菌科細(xì)菌分布廣，寄主范圍大，可作為原發(fā)和繼發(fā)病原引起多種動物疾病，本試驗(yàn)對廣東地區(qū)數(shù)家養(yǎng)殖場中分離于豬、雞、鴨的腸桿菌進(jìn)行了PMQR 基 因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac（6′）-Ib-cr及qepA 的檢測，并進(jìn)行獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)，以期對廣東地區(qū)近幾年質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因在動物體內(nèi)的分布情況，以及養(yǎng)殖場腸桿菌耐藥情況進(jìn)行了解，為進(jìn)一步研究動物源PMQR基因的傳播機(jī)制、指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 菌株來源 2007～2009年在廣東豬、禽養(yǎng)殖場分離的407株腸桿菌，經(jīng)生化鑒定發(fā)現(xiàn)有350株大腸桿菌，26株變形桿菌，21株沙門菌及10株弗勞地枸櫞酸桿菌。質(zhì)控菌E.coli ATCC 25922為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 PMQR基因的檢測 采用水煮法提取菌株DNA。引物序列見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，退火參數(shù)為：qnrA48℃45s、qnrB52℃30s、qnrS52℃30s、qnrC 50℃30s、qnrD 50℃45s、qepA 59℃30s、aac（6′）-Ib-cr55℃45s，共30 個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取適量擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%～2%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。疑似陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行序列比對以確定菌株是否為陽性。

表1 PMQR基因的PCR引物

1.3 藥物敏感性試驗(yàn) 參照CLSI2007抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂稀釋法測定407株腸桿菌對氨芐西林、頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、四環(huán)素、多西環(huán)素、萘啶酸、環(huán)丙沙星，氧氟沙星、左旋氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、卡那霉素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶進(jìn)行藥物的敏感性試驗(yàn)，質(zhì)控菌采用大腸埃希氏菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 PMQR基因檢測結(jié)果 407株腸桿菌中共有92（22.6%）株攜帶PMQR基因，其中qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA 及aac（6′）-Ib-cr 的 分 別檢出4（0.98%）、20（4.91%）、66（16.22%）、7（1.72%）、1（0.25%）、22（5.41%）株，并有27（6.63%）株同時攜帶兩種或兩種以上PMQR基因。PMQR基因陽性株P(guān)CR目的片段電泳圖譜見圖1。

圖1 PMQR基因PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 藥物敏感性測定結(jié)果 407株腸桿菌對15種藥物耐藥率在由高到低依次為磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、四環(huán)素、氨芐西林、氟苯尼考、氯霉素、萘啶酸、卡那霉素、恩諾沙星、慶大霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、頭孢曲松，且均表現(xiàn)出多重耐藥（4～15耐），而出現(xiàn)最多的耐藥表型為8耐、9耐、10耐和11耐（表2、表3）。

表2 407株動物源腸桿菌對15種抗菌藥的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表3 407株雞源腸桿菌對15種抗菌藥物的多重耐藥情況

3 討論

407株動物源腸桿菌qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA和aac（6′）-Ib-cr的檢出率分別在0.98%、4.91%、16.22%、1.72%、0.25%和5.41%，可以看出，PMQR基因在廣東地區(qū)中存在流行，且以qnrS和aac（6′）-Ib-cr為主，與近幾年國內(nèi)動物源腸桿菌報(bào)道有異［10-11］，這可能是由于菌株來源不同，以及地區(qū)性差異所導(dǎo)致的。Cavaco等人于2008年首次在河南省分離的人源沙門菌中發(fā)現(xiàn)qnrD基因，而本試驗(yàn)在2007年所分離的動物源腸桿菌中就檢測到7株qnrD陽性菌，由此推測，該基因的出現(xiàn)時間可能更早；同時提示我們，自然界中可能存在其他未被發(fā)現(xiàn)的此類耐藥基因。對于廣東地區(qū)腸桿菌，Yue等對2003～2005年232株豬源及禽源大腸桿菌的qnrA、qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr基因進(jìn)行檢測，其中qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr分別檢出1（0.43%）株，13（5.6%）株及2（0.86%）株，qnrA 沒有檢出［12］。與本試驗(yàn)相比可以看出，近幾年廣東地區(qū)的PMQR流行性明顯增強(qiáng)，而且同時攜帶多個PMQR基因的菌株比例也顯著增加。

在15種抗菌藥物中，受試菌株只對頭孢曲松的敏感率高，達(dá)到93.86%，而對于其他多數(shù)藥物的耐藥率在30%以上。超過50%的菌株多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重（8～11耐）。

本試驗(yàn)中動物源腸桿菌PMQR基因流行性，以及耐藥率高、多重耐藥的現(xiàn)象嚴(yán)重，可能是由于養(yǎng)殖場的不合理用藥、耐藥基因在不同種屬細(xì)菌間的水平傳播、細(xì)菌在動物和人之間的互相傳遞，以及交叉耐藥導(dǎo)致的，這可能會給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，耐藥性的水平傳播同時也會給人類的健康帶來巨大的隱患。因此規(guī)范畜禽養(yǎng)殖用藥，加強(qiáng)對耐藥情況監(jiān)測是獸醫(yī)臨床作業(yè)的重要任務(wù)。

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