8種中藥多糖及其硫酸化衍生物對新城疫病毒的影響

王春花，金秧敏，張燕華，李春艷，張秀英

（1.東北農業大學，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江農業經濟職業學院，黑龍江 牡丹江 157041；3.浙江大學，浙江 杭州 310058）

新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、高度接觸性的禽類烈性傳染病，給我國養禽業帶來了嚴重的危害，至今對于該病的治療仍無有效的藥物。研究表明，中藥多糖可影響NDV感染作用，但目前并無多糖藥物應用于臨床治療新城疫病毒性疾病，這除了由于體內外試驗差異因素導致外，還可能是由于中藥中所含的有效活性多糖含量低或中藥多糖本身藥效低，使多糖臨床治療效果不足，報道顯示，硫酸化修飾的方法可改變多糖的抗病毒活性。本試驗選取含多糖成分并具有抗病毒活性的中藥為研究對象，提取多糖，通過氯磺酸-吡啶法硫酸化修飾多糖，以雞胚成纖維細胞（CEF）為平臺，通過體外細胞篩選出高活性的抗NDV多糖，為多糖藥物的研究及防治新城疫病毒性疾病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與病毒 中藥黃芪，大黃，牛膝，板藍根，當歸，甘草，黃精，紫草，均購自哈爾濱世一堂藥店；所用試劑均為國產分析純；F48E9新城疫病毒由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所禽病實驗室提供；9周齡SPF雞胚由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供。

1.2 中藥多糖和硫酸化多糖的制備［1］采用傳統的水提醇沉法提取中藥多糖，硫酸化吡啶法硫酸化修飾多糖，多糖和硫酸化多糖溶液進行190～500 nm區間紫外可見光連續吸收掃描，比較修飾前后吸收峰變化。

1.3 多糖及硫酸化多糖抗NDV活性測定 雞胚成纖維細胞培養方法參照文獻［2］，選擇均勻、生長良好的細胞接種倍比稀釋NDV病毒液，培養，觀察記錄，根據Reed-Muench公式計算TCID50值。

設定兩種加藥方式，先加100μL多糖作用12 h，再加100μL病毒吸附2h組與先病毒吸附2h后作用多糖組，作用多糖濃度見表1～8，作用100TCID50病毒濃度為10-4.56，測定多種多糖對新城疫病毒的影響，每個藥物每種濃度4個孔，所有試驗均做3次重復。

CPE、OD值及選擇指數（selection index，SI）比較法綜合評價抗病毒效果，SI＝最大無毒濃度／最小有效濃度。

1.4 數據處理 試驗數據用SPSS13.0統計分析軟件進行方差分析和多重比較，數據用表示。

2 結果與分析

2.1 硫酸化多糖效果 多糖和硫酸化多糖紫外吸收峰比較看出，8種多糖經氯磺酸-吡啶法硫酸化修飾的多糖出現新的吸收峰位于260～300nm，表示硫酸酯化多糖已合成。

2.2 多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用數據 8種多糖及其硫酸化多糖抗NDV作用結果見表1～8，顯示8種多糖均具有一定抗病毒活性，以黃芪多糖效果最明顯，治療指數達8，當歸多糖、板藍根多糖次之，紫草及黃精多糖效果不顯著，治療指數低于2。硫酸化修飾后當歸和大黃多糖的抗病毒活性提高，治療指數高達16，表現強抗NDV作用。抗病毒效果比較結果見圖1，顯示8種多糖及其硫酸化修飾物作用的NDV感染后細胞，細胞OD值都高于病毒對照組，說明中藥多糖對NDV有一定的干擾作用。圖中1組先加多糖組均高于2組后加多糖組數據，說明多糖對新城疫的干擾作用主要來自對細胞的保護，只能抑制病毒的擴散而不能直接殺傷NDV。

3 討論

目前體外細胞試驗測定方法主要包括細胞病變抑制法、pH值轉變法、染色法與蝕斑降低法［3-4］，根據測定方法的優缺點，本試驗采用CPE抑制法與MTT染色相結合的方法，在CPE觀察的基礎上初步判定所選成分的抗病毒活性，然后采用MTT染色法，對所選成分的抗病毒活性的大小進行定量測定。既克服了CPE法主觀性強，不能定量分析的缺陷，又通過觀察細胞的CPE，決定進行MTT測定的最適時間，保證了結果的準確性。

試驗顯示，多糖成分對新城疫病毒感染的細胞都有一定的影響作用，與胡元亮等人［5］試驗得出結論相符。其中以黃芪和板藍根效果最好，治療指數可達8，其中關于大黃多糖，紫草多糖，黃精多糖抗NDV作用未見報道。

表1 牛膝多糖和硫酸化牛膝多糖各組細胞CPE和OD值的變化

表3 板藍根多糖和硫酸化板藍根多糖各組細胞CPE與OD值的變化

表4 當歸多糖和硫酸化當歸多糖各組細胞CPE和OD值的變化

表5 黃精多糖和硫酸化黃芪多糖各組細胞CPE和OD值的變化

表6 大黃多糖和硫酸化大黃多糖各組細胞CPE和OD值的變化

表7 紫草多糖和硫酸化紫草多糖各組細胞CPE和OD值的變化

表8 甘草多糖和硫酸化甘草多糖各組細胞CPE和OD值的變化

圖1 多糖抗新城疫病毒作用柱狀圖

試驗結果顯示，抗NDV作用比較低的牛膝多糖、大黃多糖和當歸多糖經硫酸化修飾后其對NDV抑制作用顯著增強，此趨勢與鄭民實等［6］報道的多糖修飾上硫酸根后活性增強結論一致，說明通過硫酸化修飾可使多糖抗NDV活性增強，但試驗中也發現板藍根多糖和甘草多糖經修飾后活性反而降低，分析原因可能為部分有效多糖在劇烈的化學反應中被破壞，導致抗新城疫病毒活性降低。

試驗結果表明，隨著加藥方式的不同，多糖及硫酸化多糖的抗病毒活性有差異性。先加藥物后接種病毒的目的是觀察多糖能否進入細胞或吸附于細胞表面，以阻止病毒的吸附與侵入，先接種病毒后加多糖的目的是觀察藥物能否對已進入細胞內的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放［7］。多糖抗NDV作用比較顯示，1組先加多糖組均高于2組后加多糖組數據，說明多糖對NDV的干擾作用主要來自對細胞的保護，只能抑制病毒吸附與侵入，而不能對已進入細胞內的病毒起作用，抑制其生物合成，成熟釋放或直接殺滅NDV。

［1］張惟杰.糖復合物生化研究技術［M］.杭州：浙江大學出版社，1999.

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