復(fù)方黃連注射劑的體外抑菌和耐藥抑制作用研究

游思湘，何湘蓉，孟海波，賀建華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)繼續(xù)教育學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

解決細菌的耐藥性一直是全球關(guān)注的問題，研究耐藥抑制劑成為關(guān)注的焦點［1-2］。基于中藥具有無殘留、作用靶位多、有效成分多、作用范圍廣，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，因此從中藥中篩選耐藥抑制劑成為一個新的研究方向［3］。本文以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，以清熱解毒的經(jīng)典中藥方劑-黃連解毒湯為基礎(chǔ)，采用現(xiàn)代分離純化技術(shù)和生產(chǎn)工藝對其活性成分進行分離、提取、純化和精制，制備了天然耐藥抑制劑-復(fù)方黃連注射劑，并探討復(fù)方黃連注射劑對耐藥金黃色葡萄球菌的體外抑菌和耐藥抑制作用，以便為中藥耐藥抑制劑的開發(fā)提供研究思路和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 5株耐藥金黃色葡萄球菌，均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，分離于內(nèi)蒙古奶牛乳房炎，金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 藥品 氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星等原料藥由湖南農(nóng)大動物藥業(yè)有限公司提供，上述藥物含量為98%～99%。藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。含生藥1g／mL復(fù)方黃連注射劑，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)系制備，該制劑各指標符合《中國藥典》2005年版要求。

1.3 主要儀器設(shè)備 PYX-250Z-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YXQ-IS-SII全自動高壓滅菌器；SW-CJ-I超凈臺。

1.4 耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥性檢測 采用藥敏紙片法和倍比稀釋法［4］。

1.5 復(fù)方黃連注射劑對耐藥金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗

1.5.1 最低抑菌濃度（MIC）的測定 采用倍比稀釋法［4］。將復(fù)方黃連注射劑作二倍遞減濃度稀釋，1～9號試管內(nèi)藥物濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039、0.00195g／mL。第10號試管加藥液不加菌液，作為陰性對照，第11號試管加菌液不加藥液，作為陽性對照。將各管置35℃振蕩培養(yǎng)18h后取出，觀察并判定藥物的最低抑菌濃度（MIC）。

1.5.2 藥敏試驗 取直徑為6mm的滅菌濾紙片，滴加復(fù)方黃連注射劑，自然干燥后，再滴加復(fù)方黃連注射劑，重復(fù)3次。然后取制備好的復(fù)方黃連注射劑藥敏紙片按照藥敏紙片法進行操作。

1.5.3 最低殺菌濃度（MBC）的測定 將MIC測定中的無細菌生長試管肉湯用移液器分別吸取0.1 mL培養(yǎng)物，移種于營養(yǎng)瓊脂上，推開藥液，置35℃培養(yǎng)過夜。

1.6 復(fù)方黃連注射劑對耐藥金黃色葡萄球菌體外耐藥抑制試驗

1.6.1 平板挖孔法 采用文獻［5］方法。

1.6.2 藥敏紙片法 試驗組耐藥金黃色葡萄球菌在含有抑菌濃度的復(fù)方黃連注射劑MH培養(yǎng)液中35℃振蕩培養(yǎng)過夜；對照組在MH培養(yǎng)液中35℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后取各組菌液0.1mL分別涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，貼環(huán)丙沙星或氧氟沙星藥敏紙片，置35℃培養(yǎng)18h。記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥性檢測 根據(jù)NCCLS標準［4］判讀，試驗所用耐藥金黃色葡萄球菌Sa1～Sa5菌株對氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星等抗菌藥物均具有耐藥性，為多重耐藥株。

2.2 復(fù)方黃連注射劑的體外抑菌試驗

2.2.1 復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果 復(fù)方黃連注射劑對5株耐藥性金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌的MIC測定結(jié)果

2.2.2 最低殺菌濃度（MBC）的測定 以平皿培養(yǎng)基中計數(shù)少于5個菌落者作為該藥物的最低殺菌濃度（MBC），復(fù)方黃連注射劑對Sa1，Sa2，Sa3、Sa4、Sa5耐藥性金黃色葡萄球菌的MBC分別為0.0625、0.0625、0.0312、0.0312g／mL 和 0.0625 g／mL。

2.2.3 抑菌圈直徑測定結(jié)果 復(fù)方黃連注射劑對5株耐藥性金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑測定結(jié)果見表2。

2.4 復(fù)方黃連注射劑的體外耐藥抑制試驗

2.4.1 平板挖孔試驗結(jié)果 以兩孔周圍細菌生長，但兩孔間有細菌不生長的區(qū)域，視為耐藥抑制有效；兩孔周圍及孔間細菌均生長成片狀，視為耐藥抑制無效作用的平板挖孔試驗判斷標準進行判斷：Sa1、Sa3、Sa5兩孔中間均未長菌，Sa2和Sa4兩孔之間長有少量細菌，說明復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌具有一定的耐藥抑制作用。

表2 復(fù)方黃連注射劑抑菌圈直徑測定結(jié)果

2.4.2 藥敏紙片法試驗結(jié)果 耐藥性金黃色葡萄球菌經(jīng)過復(fù)方黃連注射劑處理后，對環(huán)丙沙星和氧氟沙星藥敏紙片的敏感性變化結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 耐藥性檢測 判斷細菌對抗菌藥物的耐藥性一般通過測量藥敏紙片法與倍比稀釋法的抑菌圈直徑和MIC值獲得。本試驗按照NCCLS［4］試驗要求判讀結(jié)果，所用耐藥性金黃色葡萄球菌S1～S5菌株對氧氟沙星、諾氟沙星、阿莫西林、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星等抗菌藥物均具有抗藥性，為多重耐藥株。

表3 復(fù)方黃連注射劑處理和未處理組抑菌圈直徑測定結(jié)果 （mm）

3.2 復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用 復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌Sa1～Sa5的最低抑菌濃度均為0.0078g／mL，抑菌圈直徑在14.50～16.00mm之間，；最低殺菌濃度在0.0312g／mL～0.0625g／mL之間，體外抑菌結(jié)果表明，復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用。據(jù)有關(guān)文獻報道，很多中藥提取物或中藥復(fù)方制劑對細菌具有較強的抑制作用。如楊林富等［6］報道，黃荊提取物對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌效果，MIC為0.05g／mL。

3.3 復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌的耐藥抑制作用 環(huán)丙沙星和氧氟沙星藥敏紙片對對照組抑菌圈直徑分別為16.38～17.89 mm和16.63～17.00mm之間；對經(jīng)過復(fù)方黃連注射劑處理的試驗組抑菌圈直徑分別為27.60～30.26mm和29.50～30.60 mm之間；兩組之間差異極顯著（P＜0.01），耐藥性金黃色葡萄球菌經(jīng)復(fù)方黃連注射劑處理后對環(huán)丙沙星和氧氟沙星藥物的敏感性大大提高，說明復(fù)方黃連注射劑具有明顯的耐藥抑制作用。一些研究報道表明，采用中西結(jié)合治療，可提高抗菌藥物和中藥對耐藥菌感染的治療效果。如劉全離［7］等報道，耐先鋒霉素Ⅴ的95號菌株單用先鋒霉素Ⅴ 時抑菌圈直徑為8mm，單用中藥時抑制圈直徑為12mm，中西藥聯(lián)合使用時抑菌圈直徑擴大到19mm。王曉波［8］等報道，抗菌增效劑TMP與黃連素及蒲公英，魚腥草聯(lián)合作用后，可以明顯增強細菌對TMP的敏感性。目前有關(guān)中藥提取物或中藥復(fù)方的體外抗菌作用研究報道比較多，但中藥對耐藥菌株的抑菌情況和耐藥抑制作用如何，文獻報道較少，本試驗在這方面進行了初步嘗試，為拓寬中藥制劑的用藥范圍，減輕耐藥菌株的用藥壓力，為耐藥菌株的治療尋找新的用藥途徑提供了一定的試驗基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

復(fù)方黃連注射劑對耐藥性金黃色葡萄球菌具有明顯體外抑菌和耐藥抑制作用。中藥作為天然抗菌藥物和耐藥抑制劑將為解決急劇增多的耐藥菌感染提供一個新的選擇。

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