液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物腸衣中殘留苯乙醇胺A

劉 謙，顏 紅

（保定出入境檢驗(yàn)檢疫局，河北 保定 071051）

近年來(lái)，不斷出現(xiàn)的“瘦肉精事件”涉及我國(guó)食品安全領(lǐng)域。2011年7月，某地從飼料中檢測(cè)出了苯乙醇胺A，為新增的瘦肉精品種。苯乙醇胺與其他瘦肉精品種如萊克多巴胺等相比，同樣可使生豬長(zhǎng)速加快、皮紅毛亮、瘦肉率高。人吃了含這種瘦肉精的豬肉后，可誘發(fā)高血壓、心臟病等。

苯乙醇胺A又稱(chēng)為克倫巴胺，克侖巴胺，學(xué)名為2-4-（4-硝基苯基）丁基-2-羥基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)，被農(nóng)業(yè)部第1519號(hào)公告列為禁止在飼料和動(dòng)物飲水中使用的物質(zhì)。

目前有關(guān)瘦肉精類(lèi)殘留檢測(cè)的研究很多，相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告，1063號(hào)公告，GB／T 21981-2008，GB／T 21313-2007等，研究對(duì)象有豬肉組織［1］，動(dòng)物尿液［2］，豬肝臟和豬肌肉［3］，毛發(fā)［4］等，但是關(guān)于動(dòng)物源性食品中苯乙醇胺A的研究很少。本文建立了動(dòng)物腸衣中苯乙醇胺A殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，簡(jiǎn)便、快捷，靈敏度和準(zhǔn)確度高，檢測(cè)限達(dá)0.2μg／kg。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC TQD），美國(guó)Waters公司。MCX固相萃取柱，60mg／3mL，美國(guó) Waters公司。甲醇、乙腈、甲酸、正己烷為色譜純。氨水為分析純。實(shí)驗(yàn)室用水均使用娃哈哈純凈水。

2.0 mol／L乙酸銨緩沖溶液（pH 值＝5.2）：稱(chēng)取77.0g乙酸銨溶解于450mL水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH值＝5.2后，定容至500mL。氨水-乙腈（5＋95）：準(zhǔn)確量取5 mL氨水用乙腈定容至100mL。0.1%甲酸／水。β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶（β-Glucuronidase／aryl sulfatase）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 （1）標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液（400 ng／mL），北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所贈(zèng)，-20℃保存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：移取儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成20ng／mL。密封，4℃冷藏。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Xbridge C18柱，5μm，2.1mm×150mm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，流速0.3mL／min，梯度洗脫；進(jìn)樣體積10μL；柱溫35℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源ESI（電噴霧離子源）；掃描方式正離子掃描；檢測(cè)方式MRM（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）；離子源溫度120℃；霧化氣溫度350℃；毛細(xì)管電壓3.2kV；錐孔電壓20V。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 酶解 準(zhǔn)確稱(chēng)取2g（精確到0.01g）豬腸衣／羊腸衣樣品于50mL具塞離心管內(nèi)，加入20.0 mL乙酸銨緩沖溶液（pH值＝5.2），β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶40μL均質(zhì)混勻1min，渦旋提取5 min，超聲提取2min，37℃下避光水浴振蕩16h。

1.3.3.2 凈化 酶解液冷卻后以大于等于8000 r／min離心10min，將上清液過(guò)濾至50mL具塞離心管內(nèi)，加入15mL正己烷，用力振搖2min后以大于等于8000r／min離心10min，吸去正己烷層。下層清液做備用液。

MCX固相萃取柱依次用甲醇、水各3mL活化，取備用液全部過(guò)柱，過(guò)濾液速度小于等于2mL／min，接著依次用水、甲醇各3mL淋洗，5mL氨水-乙腈洗脫并且收集。洗脫液在45℃氮?dú)獯蹈伞Ｓ? mL的0.1%甲酸／水溶解殘?jiān)?mL正己烷用力振搖，下層液體過(guò)0.22μm膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品和加標(biāo)樣品特征離子譜圖在上述儀器條件下，保留時(shí)間為9.51min，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖1～3。圖1表示的是苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品出峰圖，圖2表示的是苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品提取離子出峰圖，圖3表示的是苯乙醇胺A添加1.25μg／kg出峰圖。可以看到，在相應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)，空白組織對(duì)測(cè)試物沒(méi)有任何干擾，苯乙醇胺A峰形尖銳而對(duì)稱(chēng)。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白陰性腸衣樣品，移取一定量標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行添加，使其濃度為0.5、1.5、2.5、4.0ng／mL。經(jīng)樣品處理過(guò)程后上機(jī)檢測(cè)，以苯乙醇胺A特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如下，線性方程為y＝142.699x＋0.49，相關(guān)系數(shù)r＝0.999。

2.2 回收率和精密度測(cè)定 稱(chēng)取空白腸衣2.0g（準(zhǔn)確至0.01g），置于50 mL具塞離心管中，設(shè)0.25μg／kg、0.75μg／kg、1.25μg／kg 3個(gè)添加水平，每個(gè)濃度做8個(gè)平行，按2.3.3項(xiàng)下方法處理，取10μL進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次。根據(jù)峰面積計(jì)算添加回收率和變異系數(shù)（CV）。添加回收率和變異系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 腸衣中苯乙醇胺A添加回收結(jié)果

2.3 靈敏度的測(cè)定 按照信噪比S／N＝3確定為檢測(cè)限（LOD），S／N＝10（LOQ）確定為定量限［5］。定量限：取空白豬肌肉組織添加濃度為0.25μg／kg，按照1.3.3項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，信噪比S／N＞10（按噪音基線放大計(jì)），表明方法的定量限可至0.25μg／kg。檢測(cè)限：取空白豬肌肉組織添加濃度為0.2μg／kg，按照1.3.3項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，信噪比S／N＞3（按噪音基線放大計(jì)），表明方法的檢測(cè)限可至0.2 μg／kg。

圖3 苯乙醇胺A添加1.25μg／kg的提取離子流圖

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 苯酚型苯乙胺類(lèi)藥物的代謝過(guò)程比較強(qiáng)［6］，蛋白結(jié)合率較高，需要酶解。而苯胺型的克倫特羅的蛋白結(jié)合率低不需要酶解。苯乙醇胺A從結(jié)構(gòu)上看沒(méi)有羥基和氨基直接和苯環(huán)相連見(jiàn)圖4，但是為了盡量提高其提取效果，將少量與蛋白結(jié)合的苯乙醇胺A游離出來(lái)，因此也采用了乙酸銨提取，β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶酶解的過(guò)程。

圖4 苯乙醇胺A結(jié)構(gòu)式

3.2 腸衣樣品的處理 腸衣是動(dòng)物內(nèi)臟中最長(zhǎng)的小腸，不同的動(dòng)物個(gè)體基質(zhì)不同，有的豬腸衣帶脂肪多，有的羊腸衣雜質(zhì)含量大，因此選用合適的組織處理方法很重要。冷卻后的酶解液用正己烷萃取，去除樣品中的大部分油脂；儲(chǔ)備液凈化過(guò)柱后，再次用正己烷萃取，得到的譜圖背景噪音低，譜圖干凈，效果比較理想。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響 基質(zhì)效應(yīng)在檢測(cè)過(guò)程中是影響很?chē)?yán)重的，用流動(dòng)相來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，與基質(zhì)校準(zhǔn)曲線差異比較大。取2個(gè)空白腸衣樣品，分別添加11ng和13ng，經(jīng)酶解凈化后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如下。

表2 流動(dòng)相配制曲線定量結(jié)果和基質(zhì)校準(zhǔn)曲線定量結(jié)果

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，對(duì)同一個(gè)樣品來(lái)說(shuō)，基質(zhì)曲線校準(zhǔn)后，檢測(cè)值高于流動(dòng)相曲線定量結(jié)果，這是由基質(zhì)效應(yīng)引起的。ESI源離子化過(guò)程在液相中發(fā)生，存在基質(zhì)成分和目標(biāo)組分競(jìng)爭(zhēng)電離的現(xiàn)象。因此在實(shí)際檢測(cè)中，一定要用基質(zhì)曲線校準(zhǔn)。

4 結(jié)語(yǔ)

用乙酸銨提取，β-葡萄糖苷酸酶／芳基硫酸酯酶酶解，針對(duì)不同的腸衣樣品，利用正己烷萃取，樣品經(jīng)MCX固相萃取柱凈化處理，液相串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，回收率和精密度均比較理想。

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