同步硝化反硝化細菌的鑒定與脫氮特性研究

張 巍

（遼寧省環境科學研究院 國家環境保護村鎮污水處理與資源化工程研究中心，沈陽110031）

近年來，中國廣泛開展了脫氮方面的研究，并且取得了階段性的進展。在已經開發的廢水脫氮方法中，生物脫氮法是目前公認的最為經濟有效的方法之一。在硝化 反硝化生物脫氮過程中，參與硝化的主要微生物硝化菌為自養菌，生長緩慢，世代時間長，需要較長的污泥齡，使得硝化成為城市污水處理廠的制約因素［1］。

不少研究和報道［2－4］已充分證明，反硝化可發生在有氧條件下，使得有關好氧硝化 反硝化生物脫氮的研究日趨活躍。目前已知的好氧硝化 反硝化菌有：糞產堿菌［5］（Alcaligenesfaecalis），泛養硫球菌［6］（Thiosphaerapantotropha），現更名為脫氮副球菌［7］（Paracoccusdenitrificans）和赤紅紅球菌［8］（Rhodococcusruber）等，它們能同時利用氧和硝酸作為電子受體以獲得高生長率。已有報道［9］Pseudomonasmendocina是典型的反硝化細菌，具有較強的反硝化活性，當硝酸鹽濃度為88.5mg／L時，反硝化速率最大，為26.2mg／（L·d），顯現出較強的厭氧氨氧化能力。利用好氧同時硝化－反硝化菌發展好氧脫氮技術具有以下優點：1）使硝化／反硝化反應在同1個反應器中進行，可以大大減少占地面積和建設資金；2）使用好氧反硝化細菌可以減少處理過程中加入調節系統pH的化學物質，降低成本；3）在處理過程中好氧反硝化菌更容易控制［10］。因此新型好氧反硝化微生物的篩選和好氧同時硝化反硝化生物脫氮技術已經成了生物脫氮領域新的研究和發展趨勢。同時，污水處理中微生物的代謝情況與溫度有關，隨著溫度降低微生物活性下降，當溫度低于4℃時，微生物的生理活動幾乎停止。北方冬季的低溫條件會對微生物的生存造成很大影響，水溫過低，會影響細菌的增殖速率和生理活性，同樣會使硝化 反硝化作用停止。少數微生物會因為基因突變而產生抗寒性，因此可以通過人工選擇的方式來培養耐低溫優勢菌種，使其在低溫下仍有較強的脫氮能力［11］。

筆者依據好氧硝化 反硝化脫氮的原理，采用低溫搖床富集、篩選具有硝化作用的反硝化脫氮菌，利用傳統與現代分子生物學相結合手段進行同步硝化 反硝化短程脫氮菌分離并鑒定確定其分類地位。為富集高效硝化 反硝化短程脫氮菌，提高硝化 反硝化脫氮過程的效率，開發高效節能低耗的硝化反硝化短程脫氮工藝提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌種來源于遼寧省昌圖污水處理廠A／O裝置中的好氧活性污泥。其他化學試劑均為市售分析純。基因組DNA抽提試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 分析儀器

分光光度計（UNICO UVTU－1901）；電子天平（LP502A）；pH 計（上海雷磁，pHs－3c），離心機（TDZ5－WS）；生化培養箱（SPX－100B－Z）；高壓滅菌鍋（HVE－50AUTOCLAVE）；電子顯微鏡（OLYMPUS CX41KF）；BIOLOG微生物鑒定系統（美國microLog）；恒溫水浴搖床（英國 OLS200）。

1.3 分析方法

菌體濃度測定采用分光光度法測定［12］。CODCr測定采用重鉻酸鉀法，NH4＋－N采用納氏分光光度計法［13］。

1.4 培養基

用于富集培養降解同步硝化反硝化細菌的培養基配方為：NaNO20.5g、牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、pH 7.0［14］。

用于分離純化同步硝化反硝化菌的培養基配方為：NaNO21.0g、Na2CO31.0g、NaH2PO40.25g、CaCO31.0g、K2HPO40.75g、MnSO40.01g、MgSO4·4H2O 0.03g、H2O 1 000mL、瓊脂15g。

1.5 菌株的富集與分離

將好氧污泥接種于4瓶250mL富集培養基中，每瓶污泥接種1.0mL，搖床培養，搖床溫度為15℃，轉速120r·min－1。4d后，將富集好的菌液稀釋后涂布于20個裝有分離培養基的平板上。將平板置于溫度為15℃的培養箱中培養，定期觀察菌體的生長情況。用接種環將平板上生長良好的菌落挑出，劃線培養于分離培養基中，翻接8～10次，將菌株分離。將分離出的菌株，劃線于普通肉汁斜面，4℃冰箱保藏。

1.6 菌株的生理生化鑒定

參照《菌種保藏手冊》［15］和《伯杰細菌鑒定手冊》［16］，對SNDB－5進行生理生化實驗。

1.7 BIOLOG鑒定

BIOLOG鑒定系統由濁讀儀、讀數儀、數據庫、軟件、微孔鑒定板組成，其實驗方法參照文獻［17］。

1.8 細菌的基因組DNA提取

采用寶生物工程（大連）有限公司的基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.9 16SrDNA擴增與測序

以SNDB－5總DNA為模板，以用DNASTAR軟件分析設計的引物P1（188bp左右有一段21bp片斷：5′－CGCTAATACCGCAT ACGTCCT－3′）和P2（1 128bp左右有1段20bp片斷：5′－CCATGCAGCACCTGTGTCTG－3′）進行擴增，反應液為50μL，含有ddH2O 40μL，dNTP 1μL，10×buffer 5μL，TaqE 1μL，模板DNA 1μL，50pmol·μL－1引物2μL。PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃1min，53℃40s，72℃40s，35個循環，最后72℃保溫6min。測序由寶生物工程（大連）有限公司完成，將測序結果用Blast軟件與Genbank中16SrDNA序列進行同源性比較。

1.10 菌株SNDB－5脫氮效能實驗（以下實驗均在好氧條件下進行）

將SNDB－5以10%的接菌量分別接種到經高壓滅菌的同步硝化反硝化培養基和NaNO2模擬廢水中，在15℃下，120r／min進行搖瓶培養，實驗裝置如圖1。每12h監測同步硝化反硝化培養基中NO2－－N、NO3－－N、菌體生長吸光度（OD600）的變化；硝化培養基及NaNO2模擬廢水中NO3－－N、NO2－－N、菌體生長吸光度（OD600）的變化。

圖1 菌株實驗裝置

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株分離純化 經過富集分離，篩選出一株同步硝化反硝化脫氮效果好的菌株SNDB－5，其在肉汁瓊脂平板上生長旺盛，菌落較大，呈乳白色。光滑，濕潤，中間隆起，不透明，無核，邊緣整齊。通過革蘭氏染色，鑒定為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下觀察菌株，發現該菌均為桿狀菌，大小為（1.5～1.8）μm×（0.4～0.6）μm（如圖2所示）。

圖2 菌株SNDB－5的顯微照片（1000×）

2.1.2 BIOLOG鑒定結果 使用Biolog自動菌種鑒定系統對該株菌進行鑒定，該菌株鑒定種屬為Pseudomonasmendocina（如圖3所示）。

圖3 SNDB－5菌的代謝指紋特征和鑒定結果

2.1.3 SNDB－5菌株的16SrDNA基因序列、基因克隆分析 在以16SForward、16SInternal和16S Reverse為引物進行DNA測序時，發現測序結果均出現連續套峰，懷疑是菌種不純所致，因此采取了克隆測序。

質粒CTD445－XT1－2測序結果符合實驗要求。登陸NCBI網站，將質粒進行序列比對，分別篩選出10余種與其相似的菌種，利用MEGA4軟件，采取鄰近法對質粒構建系統進化樹。

將測得的CTD445－XT1－2的16SrDNA序列在GenBank中進行BLAST比對，所獲得的同源序列均為Pseudomonas屬的16SrDNA序列。

將 CTD445－XT1－2 的 16SrDNA 序 列 與 Gen－Bank中相似的14種已知菌的序列進行多序列比對，運用MEGA4軟件做出進化樹，如圖4所示。

圖4 依據16SrDNA序列構建的SNDB－5及相關種的系統發育樹

由 圖3可知CTD445－XT1－2 與 EU636659.1（Pseudomonasmendocina）同源性最近，相似性高達99%。

通過BIOLOG和分子生物學鑒定，結合菌株的形態學和生理學特性，可基本確定分離的菌株為Pseudomonasmendocina。菌株SNDB－5與現已報道的好氧同步硝化反硝化菌均不相同。目前已報道的Pseudomonasmendocina具有反硝化作用，而關于硝化作用尚無報道。

2.2 菌株SNDB－5的硝化作用

以NaNO2（濃度為0.1%）為惟一的氮源，培養基在121℃滅菌20min后，取20mL放入120mL的培養瓶中，菌株活化后接種于該液體培養基中，菌株在以NaNO2為氮源的培養基上生長時，菌體生長曲線及溶液中NO3－濃度的變化曲線如圖5示。由圖4可知，菌體的硝化主要是在菌體的對數生長期發生的，而在菌體進入衰亡期后，溶液中的NO3－的濃度一直處于很低的濃度水平。碳酸鈉在好氧硝化過程中起著非常重要的作用，它不但作為細菌Pseudomonasmendocina生長所需的碳源，也是菌株進行硝化過程中能量的來源，在C／N比為2～3時，硝化速率達到最大［18］。本實驗中C／N 約為1.6，可能尚未達到該菌株最佳C／N比，需要進一步研究，以確定此時它的最大硝化速率。

圖5 菌株SNDB－5的硝化作用

2.3 不同亞硝酸鹽負荷對菌株SNDB－5的硝化作用的影響

以不同濃度 NaNO2（25、50、100、150mg／L）為惟一的氮源，培養基在121℃滅菌20min后，取20 mL放入120mL的培養瓶中，菌株活化后接種于該液體培養基中，菌株在以不同濃度NaNO2為氮源的培養基上生長時，溶液中NO2－濃度的變化曲線如圖6示。由圖6可知，菌株SNDB－5在亞硝酸鹽負荷為50mg／L時，亞硝酸鹽去除效率最高為66%。在亞硝酸鹽負荷為25mg／L時，亞硝酸鹽去除率只有19%。當亞硝酸鹽負荷大于50mg／L時，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負荷為100mg／L時，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負荷為150 mg／L時，亞硝酸鹽去除率為48%。

隨著亞硝酸鹽負荷的提高，亞硝酸鹽去除率降低，可以推斷出隨著水中的亞硝酸鹽的濃度加大，菌株SNDB－5的活性受到了抑制。

圖6 亞硝酸鹽負荷對SNDB－5生長的影響

3 結 語

1）分離的菌株SNDB－5經鑒定為Pseudomonas mendocina，它與目前所報道的好氧硝化反硝化菌均不相同，表明了自然界中好氧硝化反硝化菌的生物多樣性，對揭示好氧硝化反硝化菌群的生態學有重要的意義。

2）菌株SNDB－5能分別適應不同的亞硝酸鹽濃度，當亞硝酸鹽負荷大于50mg／L時，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負荷為100mg／L時，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負荷為150mg／L時，亞硝酸鹽去除率為48%。使得該菌株適應力較強，可能存在于含有高氮素濃度的活性污泥中，有應用于污水好氧硝化反硝化脫氮處理的潛力。隨著亞硝酸鹽負荷的提高，菌株SNDB－5的活性受到了抑制。

3）低溫條件下硝化反硝化脫氮菌的分離成功為后續高效工程菌的構建及工程應用研究提供了理論支撐和前提條件，使低溫地區污水處理廠在冬季運行時提高脫氮率成為可能。

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