犬細小病毒病診斷技術國家標準

犬細小病毒病診斷技術國家標準

1 范圍

本標準規定了犬細小病毒病的臨床檢查、血凝與血凝抑制試驗、PCR檢測的操作方法。

本標準適用于犬細小病毒病的鑒定及其流行學調查、診斷和監測。其中病毒分離、血凝與血凝抑制試驗、PCR檢測適用于犬細小病毒的病原診斷。

2 試劑和材料

2.1 FK81細胞（貓腎細胞）。

2.2 0.9%生理鹽水。

2.3 1%豬紅細胞液。

2.4 犬細小病毒陽性血清。

2.5 96孔“v”形微量反應板。

2.6 Taq酶及10倍Taq酶反應緩沖液：Taq酶濃度為5U/μL，-20℃保存。

2.7 1.5mL Eppendorf管。

2.8 0.2mL PCR薄壁管。

2.9 dNTP: 含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。

2.10 引物：濃度為20μmol/L，其序列如下：

上游引物（CPVF）：5’GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC3’；

下游引物（CPVR）：5’GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C3’。

2.11 10%十二烷基硫酸鈉：配制參見附錄A。

2.12 蛋白酶K貯備液。

2.13 5×TBE電泳緩沖液。

3 器材和設備

3.1 PCR儀。

3.2 高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃、離心速度可達12000g以上。

3.3 水平電泳儀。

3.4 凝膠成像系統。

4 臨床檢查

4.1 臨床特征

4.1.1 潛伏期1周到2周，病初無任何癥狀，食欲減退或廢絕，體溫40℃以上，粉紅色黏稠血樣物。

4.1.2 病犬先出現嘔吐，嘔吐出白色泡沫或黃色液體，繼而腹瀉，糞便稀薄而惡臭，劇烈的腹瀉呈噴射狀，糞便呈紅色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁樣稀便，并有特殊的腥臭味。

4.1.3 患犬迅速消瘦，倦臥不起，目光呆滯，眼窩下陷，腹圍緊縮，機體脫水，皮膚干燥、彈性降低。

4.2 病理變化

4.2.1 心臟腫大呈灰黃色，切面外翻，質地松軟，心肌有出血性斑紋。

4.2.2 肝臟腫大，包膜緊張，多呈黃褐色，質地松軟有局灶性壞死，斷面有豆蔻狀花紋。

4.2.3 胃空虛，黏膜輕度潮紅，附有大量黏液；小腸壁增厚，腸管變粗，腸腔狹窄，形成厚層黏膜皺褶，易于剝落，腸腔內充滿紫紅色粥樣內容物并混有血凝塊。

4.3 判定

若臨床癥狀符合4.1.1或4.1.2且出現4.2.1或4.2.3的病理變化，則可判定疑似犬細小病毒病，其他臨床癥狀和病理變化可作為參考指標；疑似病例可采用血凝與血凝抑制試驗或PCR檢測進行確診。

5 血凝與血凝抑制試驗

5.1 血凝試驗（HA）的操作方法

5.1.1 樣品采集活犬的淚液、鼻液、糞便，病死犬的肝、脾、肺等組織器官。將待檢組織或糞便樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢；口腔拭子、糞拭子用少量生理鹽水浸潤后，取上清液待檢。

5.1.2 在96孔“v”形微量反應板上進行，自左至右各孔加50μL理鹽水。

5.1.3 于左側第1孔加50μL待檢樣品混合均后，吸50μL至第2孔，混合均勻后，吸50μL至第3孔，依次倍比稀釋，至第11孔，吸棄50μL，稀釋后病毒稀釋度為第1孔1∶2，第2孔1∶4，第3孔1∶8……最后12孔為對照。

5.1.4 由左至右依次向各孔加1%豬紅細胞懸液50μL置微型混合器上振蕩，使血球與病毒充分混合，在37℃溫箱中作用15min~30min后，待對照紅細胞已沉淀可觀察結果。

5.1.5 判定結果：以100%凝集（血球呈顆粒性傘狀凝集沉于孔底）的病毒最大長稀釋孔為該病毒血凝價，即一個凝集單位，不凝集者紅細胞沉于孔底呈點狀。

5.2 血凝抑制試驗（HI）的操作方法

5.2.1 根據HA試驗結果，確定病毒的血凝價，配成4個血凝單位病毒溶液。

5.2.2 在96“v”形微量板上進行，用固定病毒稀釋血清法，自第1孔至第10孔各加50μL生理鹽水，11和12孔分別為4單位CPV細胞病毒培養液和抗犬細小病毒陽性血清對照。

5.2.3 第1孔加犬細小病毒陽性血清50μL，混合均勻，吸50μL至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50μL，如此稀釋后血清濃度為第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……

5.2.4 由第1孔至11孔各加50μL，4單位待測病毒液，第12孔50μL血清，混合均勻，置37℃溫箱再作用15min~30min，待4單位病毒已凝集紅細胞可觀察結果。

5.2.5 判定結果：被已知犬細小病毒陽性血清抑制血凝者，該病毒為犬細小病毒。

6 PCR檢測

6.1 病料的采集及處理

采集的樣品包括犬的淚液、鼻液、唾液、糞便及病死犬的肝、脾、肺等組織器官。將待檢組織或糞便樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3000g離心15min，收集上清液待檢。口腔拭子、糞拭子用少量生理鹽水浸潤后，取上清液待檢。經細胞病原分離培養的樣品，收集細胞沉淀待檢。CPV陽性對照樣品和陰性對照樣品的同樣處理。

6.2 DNA抽提

取上清液465μL，加入25μL 10%十二烷基硫酸鈉和10μL的20mg/mL蛋白酶K，50℃水浴搖床上放置2h；加入等量的飽和酚溶液500μL，振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；加入等量的酚：三氯甲烷：異戊醇（25：24：1）， 振 蕩混勻 20s，12000g離心5min，取上清液；再加入等量的三氯甲烷：異戊醇（24：1），振蕩混勻20s，12000g離心5min，取上清液；最后加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000g離心10min，棄上清，室溫干燥后，加入50μL雙蒸水溶解沉淀，即得DNA模板，-20℃貯存備用。CPV陽性對照樣品和陰性對照樣品與待檢樣品同步進行樣品處理，并進行DNA抽提。另外，DNA抽提也可采用市售的商品化DNA抽提試劑盒進行。

6.3 PCR檢測

在0.2mLPCR薄壁管中，按每個樣品10倍Taq酶濃縮緩沖液2.5μL、dNTP0.5μL、Taq 酶 0.5μL、DNA模板2μL、上游引物和下游引物（CPVE、CPVR）各 0.5μL、三蒸水18.5μL，配制PCR檢測體系。將PCR管置PCR儀上按如下程序擴增：首先94℃變性2min；再94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s進行35個循環；最后72℃、3min。用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖平板（含 0.5μg/mLEB），將平板放入水平電泳儀，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，將10μLPCR產物和2μL加樣緩沖液（6X），混勻后加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。5V/cm電泳約30min，當溴酚藍到達底部時停止，用凝膠成像系統觀察結果。

6.4 結果判定

6.4.1 經PCR檢測，CPV陽性對照樣品可擴增出大小為609bp的核酸片段，且陰性對照樣品無擴增條帶，否則試驗結果視為無效。

6.4.2 在符合6.4.1的條件下，若待檢樣品擴增出了大小為609bp的核酸片段，則初步判定犬細小病毒核酸陽性；若待檢樣品無擴增條帶或擴增條帶大小不為609bp，則判定犬細小病毒核酸陰性。

6.4.3 待檢樣品擴增出的陽性基因片段應進行核酸序列測定，若其序列與提供的比對序列的同源性大于等于90%，則可確診為犬細小病毒核酸陽性，否則判定犬細小病毒核酸陰性。

6.4.4 若犬細小病毒核酸陽性且病原分離也呈陽性，則可判定犬細小病毒感染陽性。