臍血間充質干細胞及其在新生兒缺氧缺血性腦病治療中的應用研究

白小紅，張德雙 綜述，陳 娟審校

(四川大學華西第二醫院新生兒科，四川 成都 610041)

新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-Ischemia Encephalopathy，HIE)是新生兒期常見且危害嚴重的疾病。重度HIE可以導致新生兒死亡及兒童腦癱、智力落后、癲癇等神經系統后遺癥［1］。HIE發病機制復雜，其治療及防治遠期后遺癥已成為臨床一大難題。近年干細胞治療神經系統疾病方面取得的進展，使其可以成為HIE的新的治療模式［2］。臍血間充質干細胞(Human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells，HUCB-MSCs)在一定條件下可以分化為神經元，利用HUCB-MSCs移植對已經壞死的神經元進行替代，最大程度減少重度HIE患兒的遠期后遺癥。本文對 HUCB-MSCs的基礎研究以及HUCB-MSCs治療HIE方面的進展進行綜述。

1 HUCB-MSCs的研究進展

間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，存在于骨髓、臍血、脂肪等組織。MSCs在體外誘導條件下不僅可以分化為中胚層來源的細胞如成骨細胞、脂肪細胞等，而且可以跨胚層分化為神經細胞［3，4］。Erics等［5］于 2000 年報道，從臍帶血中分離出兩種貼壁細胞，一種為破骨細胞樣，另一種為成纖維細胞樣，后者表達細胞表面抗原 SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29 和 CD49e，與骨髓來源的MSCs相同，因此這種細胞也屬于間充質干細胞。實驗證明，臍血MSCs以及臍帶MSCs都可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肝細胞骨骼肌細胞［6，7］。骨髓和臍血是 MSCs的兩個主要來源組織。臍血又有以下優點:臍血的采集方便，采集臍帶血對產婦及新生兒不會造成危害;臍血中的干/祖細胞較成人骨髓中的干/祖細胞增殖分化能力更強［8］;臍血中的淋巴細胞幼稚，免疫功能不完全，移植物抗宿主病的發生率低［9］;臍血中不會有腫瘤細胞;臍帶血中潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播概率相對較低［10］。因此，臍血是較骨髓更為理想的MSCs的來源組織。

1.1 HUCB-MSCs的分離 目前，HUCB-MSCs分離常使用的方法有以下幾種:①密度梯度離心法及貼壁細胞分離法:首先從臍帶血中分理處單個核的細胞，再根據其體外培養中貼壁生長的特性，使用貼壁篩選法將其從造血系統中分離出來。此法簡單有效，成本低廉，對細胞的損傷小，能較好的保持細胞活性，其缺點則是分離出來的細胞成分復雜，純度不高。②免疫磁珠分離法:其原理是利用表面附有特異性抗體的磁珠與間充質干細胞結合，再用永久磁鐵吸引出間充質干細胞，這樣分離出來的細胞純度較高，而且分離過程中不會影響細胞的活性。③流式細胞儀法:根據干細胞體積大小的不同或是細胞表面的特殊標志將臍血中的各種細胞分離，采用此法分離，可以獲得純度很高的干細胞，但是對干細胞活性影響很大，并且實驗條件要求高，所需的標本量大這也限制了此種方法的廣泛運用于干細胞的分離，但是其對間充質干細胞的鑒定有很大的作用。國外還有人運用單克隆的方法獲得純的MSCs細胞株，但是該方法不便于大量獲得MSCs［11］。

1.2 HUCB-MSCs的培養 HUCB-MSCs的培養具有一定的難度，培養成功率僅在25%左右［12］，且在培養方面目前還有很多爭議，尚無統一的方案。影響臍血MSCs培養效率的因素很多，除了臍血中所含MSCs數量較少的原因外，不同的培養基、pH值、胎物血清濃度和種植濃度都會影響MSCs的生長。Romanov等［13］用含10% 胎牛血清的LG-DMEM 培養基養出優質生長良好的間充質干細胞。Lee［6］用含20%牛血清、L-谷氨酰胺的IMDM培養基，并加入堿性成纖維生長因子(bFGF)，也培養出生長良好的干細胞。Ramasamy等也發現在培養基中加入bFGF可以提高干細胞的增殖，使更多的細胞停留在S期，并且不會改變臍血MSCs的免疫表型及免疫調節蛋白的功能［14］。有研究發現，運用人自體血小板裂解物(humanplatelet lysates，HPL)培養的MSCs的免疫表型以及所在生物特性與用10%胎牛血清所培養的一致，7.5%HPL可以促進 MSCs的增殖［15，16］。Zhu等對比不同培養基對 MSCs增殖分化的影響，發現低濃度的胎牛血清(2%)加上EGF，血小板衍生生長因子(PDGF)所構成的培養基可促使MSCs增殖，而15%的胎牛血清加上β-巰基乙醇則可以增加MSCs向成骨細胞的分化［17］。

1.3 HUCB-MSCs誘導分化成為神經細胞 大量實驗證明，在不同誘導條件之下，臍血MSCs可以向神經細胞分化。Lim等［18］證實，用腦源性神經營養因子(BDNF)可以刺激人臍血MSCs向神經元分化，且分化的細胞依賴MAPK/ERK和P13k/Akt的信號途徑生存。有人發現，激活蛋白激酶(PKA)信號途徑增加環磷酸腺苷(cAMP)的含量，可以增加臍血MSCs神經突樣結構和神經標志基因的表達［19］。也有實驗［20］證明，HUCB-MSCs經誘導可以在形態學、表型及功能上都能分化進入到施萬細胞。侯玲玲等［21］采用抗氧化劑誘導發現，MSCs經經誘導后可以表達神經元特異性烯醇化酶(NSE)和神經絲蛋白(NF)。Kang等［22］發現，雌激素也具有誘導臍血MSCs向神經元分化的功能。Ma等發現運用β-巰基乙醇或者丹參都可以體外誘導人臍帶Wharton's Jelly來源的MSCs像神經元分化，并且所分化的細胞表達β-tubulinⅢ、NF和GFAP等成熟神經元標志蛋白［23］。雖然臍血MSCs可以向神經細胞分化，但是所分化的神經細胞是否具有正常神經元一樣的生理生化功能以及分化成的神經細胞是否能夠長期存活，這些問題仍需要進一步研究。

2 HUCB-MSCs在新生兒HIE治療中的應用

缺氧缺血所致的腦損傷分為兩個階段:原發性損傷階段(4～6 h)和繼發性損傷階段(6～72 h)。原發性損傷階段主要是由于缺氧，細胞能量代謝失衡，酸中毒，谷氨酸鹽釋放，細胞內Ca積累，脂質過氧化作用和NO的神經毒性破壞細胞的平衡，最終導致的細胞死亡。繼發性損傷則是由于興奮性中毒、神經元的凋亡、以及星形膠質細胞的反應性激活所引起。據其發病的特點，目前主張在“三項支持，三項對癥”的基礎上加亞低溫療法，可以降低大腦和機體的代謝率，節省大腦能量消耗，以挽救瀕死神經元，減少神經元的凋亡。此外，還有運用氧自由基清除劑、鈣通道阻滯劑以及重組人促紅細胞生成素進行治療［24～25］，但這些治療措施卻對促進神經元的再生無效，HUCB-MSCs的移植治療則能使所移植的細胞向腦組織移植并定向誘導分化為神經細胞，抑制或取代壞死和凋亡神經細胞，激發內源性神經組織修復系統，實現HIE后腦功能的康復。

2.1 HUCB-MSCs移植—有效促進神經元再生大量運用臍血移植治療神經系統疾病的研究結果表明其治療效果良好。Chen等［26］從尾靜脈給予卒中模型的大鼠輸入人的臍血，觀察到移植入大鼠體內的臍血MSCs可在體內存活并遷移到損傷大腦半球，并整合到損傷的腦組織，促進損傷腦組織的恢復減輕大鼠的運動功能障礙。Borlongan等［27］在大鼠卒中模型建立后1小時即給大鼠臍血MSCs聯合甘露醇移植，發現移植后第3天，在損傷的大腦的區域沒有查見所移植干細胞，但移植組動物的腦組織損傷減輕以及神經行為功能較對照組有改善。他們推測是移植入體內的MSCs所釋放的神經營養因子通過血腦屏障到達損傷腦區域促進了腦功能恢復。Pedro等［28］在新生大鼠缺氧缺血腦損傷后3小時，通過腹腔注射的方式將臍血MSCs移植入大鼠的體內，他們發現接受了干細胞移植的動物一周后的運動感覺反射明顯改善，同時在移植后第3天，移植組的腦紋狀體和皮質的壞死及凋亡的神經元數量較對照組明顯減少。Xia等［29］也通過腦室內注射的途徑對缺氧缺血性腦損傷(HIBI)新生大鼠進行HUBCMSCs的移植，他們發現移植組的mNSS評分較對照組的明顯增高，而且腦組織的損傷也有所減輕，所移植的MSCs可以分化成為星形膠質細胞。

2.2 HUCB-MSCs移植治療腦損傷的神經修復機制 目前對于MSCs移植對于腦損傷的神經修復和重塑的機制仍然不清楚，目前主要是傾向于以下四種機制:

2.2.1 直接細胞替代機制 所移植的干細胞向受損組織細胞分化并替代受損細胞，與周圍細胞建立聯系，促進神經功能恢復。Lu等［30］將HUCB-MSCs于外傷性腦損傷后24小時經鼠尾靜脈注入大鼠體內，發現所移植的細胞可以向腦損傷區域遷移，并且表達神經元表面標志蛋白、微管結合蛋白-2(microtubule associated protein-2，MAP-2)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。更多的實驗則是證明了只有很小一部分移植入體內的干細胞能向神經細胞分化，根本不足以達到改善神經系統功能的作用［31～33］。因此，推測直接的細胞替代可能不是主要機制。

2.2.2 參與血管的形成 有研究［32］運用人臍血MSCs移植治療大鼠局灶性腦缺血，結果發現腦缺血灶周邊區域的微血管分布較對照組密集，證明了人臍血MSCs可以促進缺血灶邊緣區的微血管的增生。Chen等［33］用局灶性腦缺血大鼠的缺血腦組織提取液培養骨髓間充質干細胞，發現其表達血管內皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)明顯增加。Hess等［34］還發現 MSCs可以分化為血管內皮細胞，參與腦血管的重建。腦損傷后，在腦損傷區域的趨化因子SDF-1(stromal cell-derived factor-1)的表達水平增高，臍血MSCs表面有CXCR4(CXC chemokine receptor-4)的表達，可以使移植的MSCs向受損腦組織定植并且接受臍血MSCs移植后，腦組織的SDF-1的表達水平較對照組明顯增高［35］，這些證據都提示所移植的MSCs對腦血管再生有重要作用。

2.2.3 提高多種神經營養因子的水平 體外實驗和體內實驗［36，37］均觀察到MSCs可以增加多種營養因子的產生。Zhang［38］和 Chen 等［39］均發現 MSCs移植治療腦損傷，可以提高神經生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經營養因(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的水平，這些細胞因子可以調節細胞的增殖分化，對神經細胞起支持營養作用，減少神經損傷，并促進自體神經干細胞的分化從而恢復神經功能。

2.2.4 控制炎癥反應 Vendrame等［40］的研究顯示卒中的大鼠模型接受臍血MSCs移植后，體內炎癥反應介質TNF-α和 IL-1β的水平比對照組低，而具有抗炎作用的IL-10的水平則較對照組高，同時減少了脾釋放炎癥反應細胞(如巨噬細胞)，調節腦缺氧缺血損傷之后的瀑布式的炎癥反應。

3 問題與展望

將臍血MSCs移植作為臨床上治療新生兒HIE的常規手段之一，還有許多問題亟需解決。①臍血MSCs分離的效率仍然很低，且缺乏特異性手段鑒定何種細胞分化為神經元的潛能更大。②移植的時間窗和移植的途徑:關于移植時間窗目前有兩個觀點，有人認為在缺氧缺血腦損傷之后的24～72小時是炎癥反應的高峰期，腦的微環境不適于移植的MSCs的存活，應該在缺氧缺血損傷后72小時之后進行移植;另一觀點則認為移植MSCs可以控制損傷腦組織炎癥介質釋放，減少腦損傷程度，應該盡早進行MSCs移植。實驗中運用腦室內注射、腹膜內注射，以及經大鼠尾靜脈注射的途徑均有治療效果，但是何種移植途徑治療效果更好目前仍不確定。③促進神經修復的機制:臍血MSCs移植后可以從損傷部位觀察到MSCs分化的神經細胞，且大鼠的癥狀有所緩解，但其作用的具體機制，以及何種機制起著主要作用，這都需要進一步的研究。

臍血MSCs目前已初步應用于臨床。在國內外兒科領域，有學者［41，42］運用臍血 MSCs治療腦性癱瘓患兒，結果顯示臍血MSCs移植能有效的改善腦癱患兒的運動功能。有個案報道［43］運用臍血MSCs治療1例兒童型脊肌萎縮癥之后，該患兒的肌力提高，神經功能改善明顯。隨著研究的進一步深入，臍血MSCs移植將有望成為新生兒HIE的常規治療方法之一，給危重HIE患兒的康復帶來希望。

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