抗心磷脂抗體IgG時間分辨熒光免疫分析法的建立

胡志剛，劉 潔，葉 燕，陳國千，鄒耀紅，俞 蕾

（南京醫科大學附屬無錫市人民醫院1.檢驗科；2.呼吸科；3.風濕科，江蘇 無錫 214023）

抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA）是一種以血小板和內皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂作為靶抗原的自身抗體。ACA常見于系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病，與血栓形成、自然流產或宮內死胎關系密切［1－3］。在自身免疫反應過程中，ACA的變化以IgG為主［4］。目前對ACA的檢測主要方法為酶聯免疫分析法［3，5］。酶聯免疫分析為大分子有活性的酶標記，在靈敏度、線性范圍和穩定性方面有所欠缺，此外，測量精度也不夠高［6，7］。建立靈敏、穩定、線性范圍寬、便捷的 ACA檢測方法有重要臨床意義。本試驗采用ACA抗原（心磷脂＋β2糖蛋白I）和Eu3＋標記的鼠抗人IgG抗體，建立穩定的高靈敏度的時間分辨熒光免疫（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）法檢測人血清中的心磷脂抗體，報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑全自動TRFlA檢測儀AutoDELFIA-1235為芬蘭Perken公司產品；96孔微孔板、人重組β2糖蛋白I、心磷脂、ACA酶聯免疫試劑盒、ACA-IgG抗體標準品為德國AESKU公司產品；鼠抗人IgG二抗由中國醫學科學院基礎科學研究所提供；Eu3＋標試劑和Eu3＋發光增強液購自EG＆G-Wallac公司；N2-［p－異氰酸－芐基］－二乙烯三胺四乙酸（DTTA）為Sigma公司產品；牛血清白蛋白（BSA）購自衛生部上海生物制品研究所；Sephadex-G25為美國Pharmacia公司產品；濃縮洗滌液、增強液及反應緩沖液由江蘇省原子醫學研究所提供。其他試劑均為國產分析純。

1.2 固相抗原制備 將ACA抗原用50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 9.6緩沖稀釋制成包被液，96孔微孔板各孔加100μl，4℃包被過夜。棄去包被液，沖洗3次，每孔加250μl含3g／L BSA的上述緩沖液封閉，室溫放置2h。棄去封閉液，拍干后真空抽干，板條密封后置－20℃冷凍保存。

1.3 Eu3＋標記抗體的制備Eu3＋－鼠抗人IgG抗體參照Eu3＋標記盒說明書操作。取鼠抗人IgG抗體l ml，經PD-10柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol／L NaCl的 50mmol／L Na2CO3－NaHCO3pH 8.5緩沖液。收集蛋白峰，濃縮至2g／L。取500μl加入含0.2mg的 Eu3＋-N2-［p－異氰酸-芐基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3＋-DTTA）凍干粉的小瓶中，25℃磁力攪拌反應20h。反應液經用80 mmol／L tris-HCl pH 7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱（1×40cm）層析，全自動TRFIA檢測儀檢測，收集蛋白峰，稀釋后分裝凍干保存。

1.4 ACA－IgG抗體的測定采用二抗間接法，加用稀釋液稀釋的血清100μl到板條中，25℃反應30min后，洗滌4次，然后加分析緩沖液稀釋的Eu3＋-鼠抗人IgG抗體100μl，25℃振蕩反應30min后，洗滌6次，再加200μl增強液振蕩5min，在AutoDELFIA-1235儀上檢測熒光信號。最后從標準曲線計算樣品中的ACA-IgG抗體的含量（軟件程序機器自帶）。

1.5 試劑盒的評價（1）對試劑盒進行劑量－反應曲線的線性進行評價；（2）精密度評價：選低、中、高3份血清樣品，同時采用TRFIA法進行批內（n＝20）和批間（n＝8）精密度檢測，計算其CV%值；（3）靈敏度：測定20孔零點標準品，x—±2s為其最小測定值，即其靈敏度；（4）特異度：收集50例健康獻血者，檢測這些患者血清中的ACA-IgG抗體，計算臨床特異度；（5）相關性實驗：25例陽性血清樣品，分別用TRFIA和ELISA 2種方法進行檢測，計算其相關系數；（6）穩定性：將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比。

1.6 統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。2種方法檢測結果的一致性檢驗采用相關性分析，并計算相關系數。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Eu3＋標二抗的理化和免疫學鑒定Eu3＋標記鼠抗人抗體經sephadex G-25層析，收集第1洗脫峰，見圖1。

2.2 線性范圍將一強陽性標本從1∶12.5倍稀釋至1∶204800，線性稀釋濃度曲線見圖2，曲線呈良好線性在稀釋濃度1∶50－1∶51200的范圍內。

2.3 ACA-IgG抗體-TRFIA的考核數據處理得到ACA-IgG-TRFIA的標準曲線，如圖3所示。x軸代表熒光強度，y軸代表ACA-IgG抗體的濃度，結果顯示劑量－反應曲線呈良好線性相關。

圖1 TRFIA檢測sephadex G-25洗脫峰 圖2 TRFIA法測ACA可測量范圍 圖3 ACA-IgG抗體-TRFIA的標準曲線

2.4 精密度評價將低、中、高3份血清樣品，同時采用TRFIA法檢測，進行批內和批間精密度測試。

表1 批內精密度測試（n＝20）

表2 批間精密度測試（n＝8）

2.5 靈敏度測定20孔零點標準品，x—±2s為其最小測定值，為0.1GPL U／ml。

2.6 相關性實驗25例陽性血清樣品，分別用TRFIA和ELISA 2種方法所測結果的相關系數為0.987，呈高度相關。

2.7 臨床特異度采用自制TRFIA試劑檢測50例健康獻血者血清中的ACA-IgG抗體，陰性49份，陽性1份，特異度為98%。

2.8 穩定性試驗將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比，結合率僅下降15.8%，其余指標沒有明顯變化，說明試劑盒穩定性良好，在4℃條件下可保存1年。此外，對于ELISA方法，加入終止液后，隨著時間的延長，檢測的準確度下降；而對于TRFIA，加入增強液后，板條放至次日而基本不影響熒光結果的檢測，由此可見，TRFIA法更穩定。

3 討論

早期研究人員即發現，ACA ELISA采用牛血清作為封閉液和稀釋液時，可以更好地診斷抗磷脂綜合征（A ntiphoaphulipids vndrome，APS），進一步研究發現，APS患者的ACA與心磷脂的結合需要血清中一種磷脂結合蛋白－β2糖蛋白I（β2GPI）參與，而牛血清中恰恰含有β2GPI，自身免疫性疾病（如SLE）ACA與包被心磷脂的結合可以因β2GPI的存在而增強，即稱其為β2GPI依賴性ACA；相反，梅毒患者血清中的ACA與心磷脂的結合卻可被β2GPI抑制，因此又將這些ACA稱為非β2GPI依賴性 ACA［5，8，9］。 目 前 認 為 APS 與 β2GPI依 賴性ACA有關，而與非β2GP1依賴性ACA無關。本研究建立的是β2GPI依賴性ACA TRFIA法。

當前，檢測ACA多采用ELISA法，ELISA方法存在靈敏度低、線性范圍窄、酶標記物不穩定等諸多問題。時間分辨熒光免疫分析技術是近幾年快速發展起來的新技術，具有零本底、靈敏度高、重復性好、特異性強、線性范圍寬等特點。TRFIA技術標記離子的熒光激發光波長范圍較寬，發射光譜峰范圍窄，是類線光譜，有利于降低本底熒光強度，提高分辨率，檢測精度可達10－18mol／L。激發光和發射光之間有一個較大的Stokes位移，有利于排除非特異熒光的干擾，增強測量的特異性。標記離子螯合物產生的熒光強度高，壽命長，有利于消除樣品及環境中熒光物質對檢測結果的影響。每一秒鐘檢測樣品1000次，結果取平均值，有利于提高檢測的準確性［10－12］。TRFIA 被 廣 泛 用 于 C 反 應 蛋 白［13］、水痘－帶狀皰疹病毒-IgG抗體［14］、乙型肝炎病毒前S1抗原［12］、抗環瓜氨酸肽段抗體［6］、人巨細胞病毒IgM 抗體［7］等的檢測。

在以往ELISA法檢測ACA過程中，我們發現有大量ACA弱陽性及臨界值的存在，加上準確性和重復性欠佳，給臨床診斷這部分患者的自身免疫性狀況帶來了影響。而本試劑盒靈敏度達到0.1 GPL U／ml，遠低于正常參考上限10GPL U／ml，且高、中低三個濃度批內、批間CV均小于10%，從而能夠很好地解決這一問題。50例健康獻血員血清樣本進行ACA的檢測，特異性98%，說明本系統不僅靈敏度高，特異性也好。

與國外成熟ELISA試劑相比，2種方法所測結果的相關系數為0.987，呈高度相關，一致性較高，證明其結果可靠。線性范圍試驗顯示，將一強陽性標本從1∶12.5倍稀釋至1∶204800熒光計數值從高到低均有明顯變化，曲線呈良好線性在稀釋濃度1∶50－1∶51200的范圍內，具有很寬的量程。將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比，結合率僅下降15.8%，其余指標沒有明顯變化，說明試劑盒穩定性良好，在4℃條件下可保存1年。

時間分辨熒光免疫分析儀在國內已較普遍使用，儀器全自動操作，誤差減少，操作流程短。銪標記鼠抗人IgG抗體的制備經專業人員培訓后可成功標記，儲存時間長、無放射性污染。目前，進口或國產的ACA抗體商品試劑盒在2500圓左右，每份標本的檢測成本約30圓，而本實驗室建立的TRFIA法檢測ACA抗體的成本在10圓左右，有價格優勢。基于以上幾個方面，TRFIA法定量檢測ACA抗體的方法有望普遍應用。

總之，利用TRFIA方法定量檢測ACA抗體，靈敏度、特異度、精密度高，檢測范圍寬，試劑盒穩定可靠，對于系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病患者的病情，監測治療效果及預后具有重要意義。

［1］周建萍，柒銘銘.抗心磷脂抗體與復發性流產的關系分析［J］.中國醫師雜志，2008，10（6）：829.

［2］朱曉浚，劉次偉.系統性紅斑狼瘡患者血小板減少與血小板相關抗體和心磷脂抗體的相關性研究［J］.臨床皮膚科雜志，2007，36（4）：224.

［3］劉宗花，王謝桐，王燕蕓.肝素對復發性流產患者抗心磷脂抗體陽性血清抑制人絨毛膜癌細胞增殖的調節作用［J］.中華婦產科雜志，2007，42（11）：749.

［4］Yamamoto T，Mimura O，Kawasaki T，et al.Retinal vein occlusion followed by ischemic optic neuropathy with anticardiolipin IgG antibody：a case report［J］.Nippon Ganka Gakkai Zasshi，2009，113（10）：972.

［5］余自強，王兆鉞.抗磷脂綜合征發病機制與診療進展［J］.中華血液學雜志，2007，28（9）：643.

［6］李 梅，陳國千，葉 燕，等.時間分辨熒光免疫分析法測定抗環瓜氨酸肽抗體方法學的建立［J］.中華風濕病學雜志，2010，14（12）：815.

［7］潘宇紅，周 彬，黃 飚，等.巨細胞病毒IgM抗體時間分辨熒光免疫分析法的建立［J］.中華檢驗醫學雜志，2009，32（9）：1050.

［8］Pierangeli SS，Gharavi AE，Harris EN.Testing for antiphospholipid antibodies：problems and solutions［J］.Clin Obstet Gynecol，2001，44（1）：48.

［9］謝 飛，朱忠勇.抗心磷脂抗體檢測和抗磷脂抗體綜合征診斷［J］.中華檢驗醫學雜志，2003，26（4）：254.

［10］Barnhill HN，Claudel-Gillet S，Ziessel R，etal.Prototype protein assembly as scaffold for time-resolved fluoroimmuno assays［J］.J Am Chem Soc，2007，129（25）：7799.

［11］Huang B，Xiao H，Zhang X，et al.Ultrasensitive detection of pepsinogen I and pepsinogen II by a time-resolved fluoroimmunoassay and its preliminary clinical applications［J］.Anal Chim Acta，2006，571（1）：74.

［12］胡志剛，劉 潔，陳國千，等.時間分辨免疫熒光定量檢測乙型肝炎病毒前S1抗原的研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2006，29（5）：407.

［13］Parra MD，Tuomola M，Cabezas-Herrera J，et al.Analytical and clinical validation of a time-resolved immunofluorometric assay（TR-IFMA）for canine C-reactive protein in serum［J］.Vet Res Commun，2006，30（2）：113.

［14］Maple PA，Gray J，Breuer J，et al.Performance of a time-resolved fluorescence immunoassay for measuring varicella-zoster virus immunoglobulin G levels in adults and comparison with commercial enzyme immunoassays and Merck glycoprotein enzyme immunoassay［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13（2）：214.