槲寄生堿體外通過激活Caspase8誘導ACC細胞的凋亡

邱心如，周洪瀾，李亞娟，張麗紅，翟穎仙，王醫(yī)術＊

（1.吉林大學a.藥學院2009級；b.第一醫(yī)院；c.病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.四平市中心人民醫(yī)院）

唾液腺腺樣囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，大約占唾液腺惡性腫瘤的20%［1］。近年來，槲寄生Viscum Coloratum（Kom.）Nakai的抗癌作用受到國內外醫(yī)藥學界的極大重視。在亞洲，韓國對槲寄生抗癌作用的研究較多，他們主要提取槲寄生的外源凝集素（Lectins）作抗癌研究［2，3］。在我國，早在1994年王慶瑞等人就曾經報道，槲寄生的總生物堿具有較強的抗腫瘤作用，是槲寄生中有效的抗腫瘤成分之一［4］。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用［5，6］。基于此，本實驗主要研究槲寄生堿作用ACC細胞后，Caspase家族中關鍵因子Caspase8的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

藥物及試劑：槲寄生堿粉末由吉林大學基礎醫(yī)學院藥化實驗室制備；新生牛血清購于TBD公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；5－氟尿嘧啶購自天津金耀氨基酸公司；ACC細胞購于中國科學院上海生命科學研究院。Caspases8多克隆抗體購于Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 槲寄生堿的配制 根據文獻采用稀鹽酸浸提法［1］提取，用 NaOH 將pH 值調至6.5左右，制成槲寄生堿溶液，濃度為1mg／ml。

1.2.2 細胞培養(yǎng) ACC細胞培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中，培育在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，達到對數生長期后，進行實驗分組：①對照組：未用槲寄生堿處理的正常生長細胞；②陽性對照組：采用5-FU處理ACC細胞；③實驗組：采用槲寄生堿（2.24μg／ml）處理 ACC細胞。

1.2.3 細胞爬片 加藥后立即將細胞（5×104／ml）接種于已經鋪好蓋玻片的24孔板內，37℃、5%CO2培養(yǎng)24小時后0.1%PBS沖洗，10%中性福爾馬林固定，于－20℃冷藏備用。

1.2.4 caspase8活性的檢測 免疫組織化學染色采用SP法。

2 結果

2.1 Caspase8的表達情況

Caspase8免疫組織化學染色發(fā)現，槲寄生堿作用組ACC細胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達，并且隨著堿濃度的升高，表達增強。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細胞胞漿無明顯棕黃色反應物（P＜0.001）（結果見表1，圖1）。

表1 ACC細胞Caspase8表達的IOD值（±s）

表1 ACC細胞Caspase8表達的IOD值（±s）

各組間比較P＜0.001

組別 劑量（μg／ml） IOD值－ 168818.2±11592.21槲寄生堿組 2.24 723574.7±8007.34 5-FU 組未加藥組111.90 664603.9±8540.64

圖1 ACC細胞Caspase8的表達（100×）

3 討論

細胞的凋亡涉及到一系列基因的激活、表達及調控，其過程大體上可以分為三個階段［7］：接受凋亡相關信號→整合信號，凋亡調控分子間相互作用→蛋白水解酶（Caspase）激活，進入不可逆的連續(xù)反應過程。在不同的凋亡途徑當中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate specific protease，Caspase）發(fā)揮了關鍵性作用［8］。文獻顯示，在死亡受體途徑中，細胞膜上的Fas被激活后，將凋亡信號傳導入胞內，自身形成三聚體，通過DD（death domain，死亡結構域）與FADD（Fas associated protein with death domain，Fas相關死亡結構域蛋白）結合，而FADD中含有的 DED（death effected domain，死亡效應結構域）是Caspase8中CARD（Caspase activation and recruitment domai，Caspase激活募集結構域）的一種，從而使procaspase8自身水解活化，進一步去激活Caspase3來促進細胞的凋亡［9］。誘導Caspase8才能實現其凋亡過程。李鋼琴等人在實驗中證實丹皮酚即是通過上調Fas、Caspase8的表達來誘導大腸癌HT－29細胞的凋亡［10］。韓陽等人亦在實驗中證實Caspase8在死亡受體途徑中第一步被激活，進而活化下游的Caspase來誘導細胞凋亡［11］。

基于此，本實驗研究的目的是槲寄生堿作用SACC后觀察caspase8表達情況，結果顯示Caspase8免疫組織化學染色發(fā)現，槲寄生堿作用組ACC細胞胞漿有棕黃色顆粒，呈陽性表達，并且隨著堿濃度的升高，表達增強。陽性率高于5-FU組（P＜0.001），未加藥組細胞胞漿無明顯棕黃色反應物（P＜0.001）。因此，可以認為槲寄生堿通過Caspase8誘導ACC細胞凋亡，槲寄生堿有可能成為一種治療腺樣囊性癌的有效藥物，它的研制與開發(fā)利用，將為人類攻克腫瘤這一頑疾開辟一條新的道路。

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［10］李鋼琴，譚詩云，劉長青，等.Fas／FasL、bcl 2、caspase 8在丹皮酚誘導大腸癌細胞凋亡中的相互作用及機制［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2006，15（2）：194.

［11］韓 陽，官大威，侯震寰，等.caspase-8及其研究進展［J］.中國法醫(yī)學雜志，2006，21（2）：94.