rhKD／APP在腎缺血再灌注損傷大鼠炎性反應平衡中的器官保護作用

李 帆，張馨木，崔常雷，韓樹海＊

（1.吉林大學第一醫院 麻醉科，吉林 長春 130021；2.吉林大學藥學院）

rhKD／APP在腎缺血再灌注損傷大鼠炎性反應平衡中的器官保護作用

李 帆1，張馨木2，崔常雷1，韓樹海1＊

（1.吉林大學第一醫院 麻醉科，吉林 長春 130021；2.吉林大學藥學院）

＊通訊作者

牛胰蛋白酶抑制劑（Bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）作為Kunitz屬絲氨酸蛋白酶抑制劑的典型代表，是目前研究的最廣泛的蛋白酶抑制劑家族之一，被廣泛的應用于臨床器官保護。但由于其異源蛋白的局限性限制了其臨床應用。重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑rhKD／APP與BPTI有42%的同源性，體外培養發現其具有光譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性［1］。我研究小組已經報導了rh－KD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠具有保護作用［2］，本試驗研究其在大鼠腎缺血再灌注損傷過程中對于組織過氧化物酶（MPO）、腫瘤壞死因子（TNF-a）和核因子（NF-κB）的影響，探討rhKD／APP在腎缺血再灌注炎癥損傷中的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料健康雄性Wistar大鼠60只，體重250g－300g，由吉林大學實驗動物中心提供。隨機分為6組（n＝10）：Ⅰ組為偽手術組；Ⅱ組為腎I／R模型組，夾閉大鼠雙腎腎蒂，制備腎臟缺血再灌注模型［3］；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別為rhKD／APP小、中、大劑量組，腎I／R＋ 尾靜脈注射rhKD／APP 1、2 、4萬KIU／kg（吉林大學再生醫學科學研究所生化室提供）；Ⅵ組為為依那普利組（對照組），腎I／R＋尾靜脈注射依那普利0.134mg／kg（江蘇省常州制藥廠有限公司）。Ⅰ、Ⅱ組大鼠于造模前24小時，模型建立后即刻，模型建立后24小時尾靜脈注射生理鹽水，Ⅲ－Ⅴ組大鼠于上述各時間點經尾靜脈注射小、中、大劑量的rhKD／APP，Ⅵ組（對照組）大鼠于上述各時間點經尾靜脈注射依那普利。

1.2 實驗方法再灌注48小時給藥后，自腹主動脈取血3－4ml，離心（2 500rpm）10min，取血清0.1 ml，ELISA法測定TNF-a（上海森雄科技實業公司腫瘤壞死因子測定試劑盒）。取腎組織與MPO測定試劑盒（南京建成生物公司）提供的勻漿介質，按腎重將腎組織制成5%組織勻漿液，測量腎組織MPO值。另取腎臟組織多聚甲醛液中固定，制備石蠟塊。使用核因子免疫組化試劑盒（武漢博士德生物公司）測定核因子，利用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統，分別計算陽性細胞數N1，總細胞數N；同時進行陽性細胞著色強度（F）判斷：淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，最終的陽性積分＝N1／N＊F。

1.3 統計學方法采用SPSS軟件包進行數據處理和統計分析，實驗結果以±s表示，計量指標兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織MPO、血清TNF-a的影響

模型組MPO、TNF-a活性較偽手術組顯著增高；大劑量組MPO、TNF-a活性較模型組顯著降低（P＜0.01），大劑量組對腎缺血再灌注大鼠腎組織MPO、TNF-a活性的影響優于對照組；中劑量和小劑量組腎組織MPO、TNF-a活性較模型組有明顯降低（P＜0.05），與對照組表現相近。

表1 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組MPO、TNF-a活性（±s，n＝10）

表1 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組MPO、TNF-a活性（±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 TNF-a（U／L） MPO（U／L）偽手術組 8.53±2.3＊＊ 16.53±7.3＊＊模型組 41.72±17.8 34.12±15.8小劑量組 12.67±14.9＊＊ 29.63±16.7＊中劑量組 8.02±14.8＊ 28.82±15.8＊大劑量組 5.73±15.7＊ 25.48±8.9＊＊對照組 7.57±16.3＊ 28.57±15.3＊

2.2 rhKD／APP對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織核因子（NF-κB）表達的影響

模型組腎組織核因子表達較偽手術組顯著增多（P＜0.01）；小劑量組、中劑量組、大劑量組腎組織核因子表達均較模型組顯著下調（P＜0.01），與對照組作用相近。

表2 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組腎組織核因子（NF-κB）表達（±s，n＝10）

表2 大鼠腎缺血45min再灌注48h后各組腎組織核因子（NF-κB）表達（±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 NF-κB偽手術組 1.27±0.88＊＊模型組 6.0±1.46小劑量組 3.61±0.82＊＊中劑量組 3.49±0.69＊＊大劑量組 3.21±0.74＊＊對照組 2.93±0.86＊＊

3 討論

腎缺血再灌注有關的炎癥反應在IRI損傷中起著非常重要的作用，其中細胞因子在其發生、發展中的作用越來越引起學術界的廣泛關注。缺血和再灌注早期產生的黏附分子和細胞因子構成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉變的基礎［4，5］。再灌注時中性粒細胞在缺血區血管內聚集，同時伴有血管內皮腫脹、血小板淤積阻塞微血管，形成無復流現象（no reflow phenom inon）。且中性粒細胞激活時產生的炎癥介質、細胞因子、氧自由基，均參與腎臟組織損傷。腎缺血再灌注損傷可能從多種途徑啟動了炎癥信號，激發炎癥級聯擴大效應的進一步損傷，包括組織損傷誘導的炎癥、應激誘導的炎癥、氧自由基損傷誘導的炎癥以及炎癥細胞的自身激活與正反饋等途徑。

MPO是炎癥反應中活化的中性粒細胞、單核細胞、組織巨噬細胞分泌的一種過氧化物酶。MPO是中性粒細胞聚集的特征酶，通過對MPO活性的測定可較明確地反應中性粒細胞聚集的程度。炎癥反應急性期大量釋放的MPO通過催化氧化產物的大量生成，破壞一氧化氮的調節作用，將炎癥反應、氧化應激和內皮細胞功能障礙內在鏈接，形成一個惡性循環。rhKD／APP可以通過抑制人體多種以絲氨酸為活性中心的酶來發揮其抑炎功效。

NF-κB是存在于細胞質內的一組蛋白質家族，它們是細胞內最重要的活性蛋白轉錄調節因子，它調控大量基因的轉錄，包括細胞因子、生長因子、趨化因子、黏附因子、凋亡調控因子、炎癥通路蛋白、細胞應激蛋白等，是細胞質內最重要的轉錄因子家族，大量炎性蛋白質的表達是細胞損傷和修復過程中最重要的分子生物學事件［6］。在缺血再灌注損傷超早期，應激、活性氧和炎癥誘導了NF－κB的活化和相應炎癥因子信號轉導；而隨之發生的細胞凋亡反饋激活了NF－κB的凋亡拮抗信號轉導，使凋亡相關基因的轉錄下調，因此腎缺血再灌注損傷NF－κB的信號轉導結果是各種細胞核基因轉錄的凈結果。絲氨酸蛋白酶抑制劑rhKD／APP能夠特異性拮抗NF－κB絲氨酸蛋白酶依賴的炎癥信號，卻不影響NF－κB的酪氨酸蛋白酶依賴的凋亡拮抗信號，因此，絲氨酸蛋白酶抑制劑在NF－κB的信號轉導途徑中，從兩個途徑即抗炎和抗凋亡途徑，發揮腎缺血再灌注損傷的器官保護［7］。

本實驗結果顯示，大鼠腎臟MPO、血清TNF-a活性均顯著降低，這說明rhKD／APP抑制了炎癥反應的中性粒細胞的活化及炎性因子的釋放。同時rhKD／APP各個劑量組的核因子（NF-κB）的表達均明顯降低，說明rhKD／APP通過抑制NF－κB的過度表達發揮了抗炎作用。提示rhKD／APP可能是通過抑制中性粒細胞黏附、聚集、浸潤，降低細胞因子、黏附分子的表達、抑制NF-κB的過度表達，阻止或減輕了炎癥級聯放大效應，從而對腎缺血再灌注大鼠發揮器官保護作用。同時rhKD／APP作為人源蛋白較BPTI具有更廣闊的臨床應用前景。

［1］White TD，Deborah L，David，D.et al.United States Patent，2003，6：613.

［2］韓樹海，崔常雷，張馨木，等.rhKD／APP對腎臟缺血在灌注損傷大鼠的腎保護作用［J］.中國實驗診斷學，2008，12（9）：1105.

［3］李廣宇，周南，王利民，等.小鼠急性缺血－再灌注腎損傷模型的建立及體會［J］.嶺南現代臨床外科，2005，5（4）：308.

［4］Okusa MD.The inflammatory cascade in acute ischemic renal failure［J］.Nephron，2002，90（2）：133.

［5］Bonegio R，Lieberthal W.Role of apoptosis in the pathogenesis of acute renal failure［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2002，11（3）：301.

［6］Pompermayer K，Souza DG，Lara GG，et al.The ATP-sensitive potassium channel blocker glibenclam ide prevents renal ischem iareperfusion injury in rats［J］.Kidney Int，2005，67（5）：1785.

［7］Meldrum KK，Metcalfe P，Leslie JA，et al.TNF-a neutralization decreases nuclear factor-kappaB activation and apop tosis during renal obstruction［J］.Surg Res，2006，131：182.

1007－4287（2012）01－0034－02

2010－09－26）