大腸癌易感基因hMLH1、hMSH2的篩查

侯睿智，安治國，魏 君，毛靜濤，侯治富＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033；2.北京龍邁達科技有限公司，北京 100176）

大腸癌易感基因hMLH1、hMSH2的篩查

侯睿智1，安治國1，魏 君1，毛靜濤2，侯治富1＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033；2.北京龍邁達科技有限公司，北京 100176）

目的 探討hMLH1、hMSH2基因多態性與大腸癌發病危險的研究。方法采用大樣本隨機對照試驗，運用PCR和DNA直接測序方法，篩查外周血單個核細胞DNAhMLH1、hMSH2基因多態性。結果大腸癌組hMLH1-exon12 1151T→A的突變陽性率為12.20%，與對照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）；而hMSH2-exon1 IVS1＋9C→G的突變陽性率為46.70%，與對照組（33.33%）相比差異顯著（P＜0.05）。在各年齡組間，hMLH1-exon12、hMLH1-exon12突變無顯著性差異（P＞0.05）。危險性分析表明，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生大腸癌的相對危險性為無基因突變組的1.75倍，若不攜帶基因突變，其腸癌發病率將降低42.9%；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生，則大腸癌的發病率將降低20%。結論hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變可作為大腸癌發病的危險因素，并可作為檢測指標。

大腸癌；多態性；hMSH2

（ChinJLabDiagn，2012，16：0049）

hMSH 2基因位于染色體區域2p 21，在遺傳連鎖分析中，是最早被確定的影響遺傳性非息肉性大腸癌（HNPCC）綜合征的一個重要的候選基因。其編碼產物hMSH 2蛋白與hMSH 6或hMSH 3形成異二聚體，并以異二聚體復合物的形式識別、結合DNA復制中的錯誤位點，借以消除子代序列中的錯誤，使DNA復制按照母模板序列正常復制。

hMLH1基因位于染色體3p 21－23，與hMSH 2基因一樣與HNPCC有關。其基因編碼產物hMLH1蛋白本身無酶活性，與hMLH3，hPMS2或hPMS1形成異二聚體，借以結合其他的DNA修復蛋白。

早期的研究表明，hMSH2基因的16個外顯子和hMLH1基因的19個外顯子都能發生致病性突變。目前尚沒有關于這兩個基因致病性突變、或是多態性的評價標準。在本項研究中，試圖通過大樣本隨機對照試驗，探索在大腸癌中這種突變的致病性或致病危險性。

1 對象與方法

1.1 患者選擇與分組150例大腸癌患者均為2007年－2009年吉林大學中日聯誼醫院住院病例。其中，男性86例，女性64例；平均年齡為49.5歲。診斷標準采用全國大腸癌病理研究協作組2002年制定的《全國大腸癌病理研究統一規范》。另選取150例健康體檢者作為對照，其中男性79例，女性71例；平均年齡47歲。

1.2 去靜脈全血，分離單個核細胞提取DNA，用QIAGEN旋轉柱純化樣本。

1.3 PCR擴增目的基因片段由寶生物工程（大連）有限公司合成引物。hMLH1-exon12上游引物5′-ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG-3′，下 游引 物 5′-TGTCTTATCCTCTGTGACAATGG-3′。hMSH2-exon1上游引物 5′-TCGCGCATTTTCTTCAACC-3′，下 游 引 物 5′-GTCCCTCCCCAGCACGC-3′。PCR循環參數為：充分變性95 ℃、5 mins，變性95℃、40s，退火55℃、40s，延伸72℃、60s。35個循環，再充分延伸72℃、5mins。經瓊脂糖電泳鑒定PCR產物。

1.4 DNA序列測定PCR反應管內加入1μl的3M醋酸鈉，1μl EDTA和25μl無水乙醇，吹打混合均勻。室溫放置15－30min，12 000rpm，4℃15－20min離心，小心吸棄溶液，加入70%的乙醇漂洗，12 000rpm，4℃8－10min離心，再次加入70%的乙醇漂洗，上述條件離心，開蓋閉光晾置，至殘余酒精徹底揮發干凈，使PCR產物純化。加入10μl hidi（甲酞胺），95℃變性2－3min，立即冰浴，即可上機。比較在測序圖上的相應堿基序列峰型，如果出現峰型重疊，根據峰型的顏色、波幅，判定置換的堿基。

1.5 統計方法采用SPSS13.0統計軟件，對hMSH2基因IVS1＋9C→G、hMLH1基因1151T→A多態性進行危險度（Risk）分析和等級相關分析。

2 結果

2.1 PCR擴增結果對150例健康體檢者、150例大腸癌患者外周血單個核細胞DNA進行hMLH1-exon12、hMSH2-exon1 擴 增 后，分 別 在 216bp 和281bp處獲得了擴增產物。其中有147例健康體檢者、82例大腸癌標獲得hMLH1-exon12擴增出結果；126例健康體檢者、90例大腸癌標本獲得hMSH2-exon1擴增出結果。

2.2 DNA序列分析結果對147例健康體檢者和82例大腸癌患者hMLH1-exon12擴增PCR產物進行DNA序列分析（結果見表1，2）。

統計結果表明，大腸癌組的突變陽性率為12.20%，與對照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）。

Tab.1 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer patients

Tab.2 hMLH1-exon12 1151T→A in colorectal cancer of different ages

在各年齡組間，hMLH1-exon12 1151T→A突變陽性率的Kendall等級相關分析表明，無顯著性差異，χ2近似于零，P＞0.05）。

對126例健康體檢者和90例大腸癌患者hMSH2-exon1擴增PCR產物進行DNA序列分析（結果見表3，4）。

Tab.3 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer patients

結果表明，大腸癌組的突變陽性率為46.70%，與對照組（33.33%）相比差異顯著（P＜0.05）。

危險性分析表明，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生大腸癌的相對危險性（OR）為無基因突變組的1.75倍；在對照組中，若不攜帶基因突變，其腸癌發病率將降低42.9%（特異危險性百分比AR%）；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生，則大腸癌的發病率將降低20%（人群特異危險性百分比PAR%）。

Tab.4 hMSH2-exon1IVS1＋9C→G in colorectal cancer of different ages

在各年齡組間，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變陽性率的Kendall等級相關分析表明，無顯著性差異（χ2＝0.139，P＞0.05）。

3 討論

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球第三個最常見的癌癥，位居肺癌和乳腺癌癌癥之后。60%發生在較發達地區。按年齡標準化率和累計計算，0－74歲人群中大腸癌的發病率和死亡率有明顯的地理變異。在世界各地，捷克發病率最高（43／10萬），非洲（3.6／10萬，除南非）和中南亞（4.5／10萬）發病率最低。歐洲CRC死亡率最高，中非地區死亡率最低。

根據中國衛生部2002年的報告，結直腸癌的發病率已由70年代的第6位升至90年代的第3位，并且年死亡率上升至10.25／10萬，在世界范圍內處于較低水平［1－4］。

大腸癌的確切病因仍不清楚，隨著人們對家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性大腸癌認識的深入，追尋遺傳標志篩查大腸癌成為當今的熱點。本課題組的前期研究也表明，大腸癌p53基因突變率為44%，并于ras基因協同突變［5，6］。揭示了大腸癌發生演變中的遺傳因素的作用。

關于MMR基因突變，國內外有較多的文獻報道。特別是在遺傳性非息肉性結直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）的研究中，己有大量的錯配修復基因突變資料的積累。在HNPCC中絕大多數的腫瘤是由hMSH2和hMLH1基因的胚系突變引起的，其中hMSH2基因的突變占31%，hMLH1占33%。在散發性結腸癌和胃癌中，己報道的hMLH1基因的突變（42%），較hMSH2基因高（8%）［7］。

有研究發現，至少在白人中hMLH1的 WS14－19多態位點的A和G兩種基因型，預實驗的數據提示這種多態與部分直腸癌的發病有關。Hutter等報道，在結直腸癌患者中hMLH1的突變型IVS14-19G基因型較正常人群的高，分別為55.5%和39.2%，相關危險性G是A的1.93倍。除了荷蘭患者組，其余各組亦得到相同結果。錯配修復基因PMs2中的SNPs與MLH1之間存在蛋白水平的相互作用，可導致基因的改變，進而影響表達蛋白的功能，這三種多態均增加了HNPCC發生危險［7］。

本研究采用了PCR-DNA Direct sequencing技術，針對大腸癌患者的外周血單個核細胞的DNA進行了檢測，進一步深入研究hMSH2和hMLH1基因多態與大腸癌發病的相關性和危險性。研究結果表明，hMLH1-exon12 1151T→A突變陽性檢出率，大腸癌組為12.20%，與對照組（6.10%）相比，無顯著差異（P＞0.05）。在各年齡組間的Kendall等級相關分析結果無顯著性差異（χ2近似于零，P＞0.05）。在hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變分析中，大腸癌組的突變陽性率為46.70%，顯著高于對照組（33.33%）（P＜0.05）。進一步的危險性分析提示，攜帶hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生大腸癌的相對危險性（OR）為無基因突變組的1.75倍；在對照組中，若不攜帶基因突變，其腸癌發病率將降低42.9%（特異危險性百分比AR%）；若在人群中無hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變發生，則大腸癌的發病率將降低20%（人群特異危險性百分比PAR%）。在各年齡組間，hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變陽性率的Kendall等級相關分析無顯著性差異（χ2＝0.139，P＞0.05）。

盡管這一結果與國外有關大腸腫瘤hMLH1基因和hMSH2基因變異的蛋白表達水平研究結果不完全一致，但結果提示，hMSH2基因突變不僅與HNPCC的發病有關，而且與一定比例散發性大腸癌有關，并且認為hMSH2基因是誘導細胞凋亡而導致腫瘤抑制的一個重要機制。因此，篩查hMSH2-exon1IVS1＋9C→G突變，仍然可以作為大腸腫瘤篩查、早期診斷的參考指標。

［1］Miladinov-Mikov M，Lukic N，Petrovic T.Epidemiological characteristics of colorectal cancer in Vojvodina［A］.In：Riboli E，Lambert R，editors.Nutrition and Lifestyle：Opportunities for Cancer Prevention［C］.International Agency for Research on Cancer.Lyon：IARC Sci Publ，2002：156，547.

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［7］Hutter P，Wijnen J，Rey-Berthod C，et al.An MLH1haplotype is over-represented on chromosomes carrying an HNPCC predisposing mutation in MLH1［J］.J Med Genet，2002，39（5）：323.

Screening of susceptible gene hMLH1and hMSH2in Colorectal cancer

HOURui-zhi，ANZhi-guo，WEIJun，etal.（China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033，China）

ObjectiveTo explore the hMLH1，hMSH2gene polymorphisms and colorectal cancer risk.MethodsUsing large sample randomized controlled trials，hMLH1，hMSH2gene polymorphism of peripheral blood mononuclear cells DNA were screened by PCR and DNA direct sequencing.ResultshMLH1-exon12 1151T-＞A mutation in colorectal cancer group was 12.20%，there is no significant difference comparing with control group（6.10%）（P＞0.05）；hMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation（46.70%）was significantly higher than control group（33.33%）（P＜0.05）.But there is no significant difference in ages（P＞0.05）.Risk analysis shows that，the relative risk with hMSH2-exon1IVS1＋9CG mutations in colorectal cancer is 1.75times of control group.The incidence of colorectal cancer will be reduced by 42.9%if it do not carry the gene mutation，and be reduced by 20%in population.ConclusionhMSH2-exon1IVS1＋9C-＞G mutation can be used as the pathogenesis of colorectal cancer risk factors，and can be used as the testing index.

Colorectal cancer；polymorphism；hMSH2

1007－4287（2012）01－0049－03

吉林省科技發展計劃項目（200705308，20090738）

＊通訊作者

R735.3＋4

A

2010－11－29）