NK4基因轉染對人宮頸癌細胞CaSki生物學特性的影響

王曉黎，王冬冬，賴亞新，林蓓

（中國醫(yī)科大學1.附屬第一醫(yī)院內分泌科，沈陽 110001；2.附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，嚴重威脅全球女性的健康與生命［1］。隨著人乳頭瘤病毒感染的蔓延和播散，宮頸癌的發(fā)病年齡已出現(xiàn)明顯的年輕化趨勢，目前的治療方案以手術和放射治療為主，但中晚期患者治愈率很低。因此，研究宮頸癌的治療新策略顯得尤為重要。

NK4（an N-terminal hairpin domain and a four-Kringle domain of hepatocyte growth factor）是通過對重組人肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）進行消化裂解后得到的一種多肽產(chǎn)物，它由HGF的a鏈N末端的447個氨基酸和4個Kringle區(qū)域所組成，故命名為 NK4，分子量為 50 kDa［2］。NK4可以與c-Met結合，競爭性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用，影響HGF/c-Met通路的信號轉導，從而抑制HGF誘導的細胞增殖、運動和形態(tài)形成等作用，但其本身不能誘導c-Met的酪氨酸磷酸化而使其活化。NK4與血管抑制劑—血管抑素的結構具有顯著的相似性，有很強的抗血管生成作用［3］。體外研究證實，NK4可抑制HGF誘導包括人膽囊癌、膽管癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等細胞的運動和侵襲［4～7］。為了研究NK4在宮頸癌中的作用，本研究通過轉染NK4基因表達質粒，研究了它對宮頸癌細胞CaSki生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

宮頸癌細胞株Caski培養(yǎng)在含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 基因轉染

將NK4基因表達序列插入pCMV-IRES-bsr質粒的SmaI位點，構建pCMV-NK4-IRES-bsr質粒，同時構建pCMV-LUC（熒光霉素）-IRES-bsr質粒作為對照。用標準的磷酸鈣沉淀方法轉染CaSki細胞。經(jīng)過4周的熒光霉素篩選得到NK4穩(wěn)定表達的CaSki/NK4細胞株和CaSki/LUC對照細胞株。

1.3 轉染細胞NK4蛋白表達測定

選擇耐藥克隆株應用Western blot檢測NK4蛋白表達。將CaSki/NK4細胞和對照細胞株CaSki/LUC置于直徑6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞融合度達80%時換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取上清液檢測NK4蛋白表達。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移到醋酸纖維素膜上，加入一抗HGF-α（N-17）：sc-1357（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.），孵育過夜，TBST沖洗3次，加入二抗antigoat IgG孵育1 h，TBST沖洗3次后，曝光顯影。

1.4 抑制c-Met磷酸化測定

將CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4的培養(yǎng)基分別轉入有5×105個CaSki細胞的3.5 cm培養(yǎng)皿中孵育過夜后，收集細胞裂解液，用c-Met抗體按照試劑盒說明書步驟免疫沉淀后（Dynabeads protein A immunoprecipitation kit，Invitrogen 公司），用 Western blot檢測c-Met及其活化后產(chǎn)物p-Met在不同培養(yǎng)基中生長的細胞內的表達。

1.5 細胞生長曲線測定

應用MTT試劑盒測定細胞生長曲線。按每孔100個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL，將培養(yǎng)板移入37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)，每24 h在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸、光吸收值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

1.6 細胞劃痕實驗

將 2×105個 CaSki、CaSki/LUC 和 CaSki/NK4 細胞分別在3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至細胞融合度達90%，用200 μL槍頭分別在3個培養(yǎng)皿中央垂直做1條相同寬度的劃痕，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，計數(shù)劃痕中的細胞個數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結果以±s表示，組間比較采用組間Student′st檢驗。使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NK4蛋白的表達

應用 Western blot方法檢測 CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4細胞培養(yǎng)基上清液中NK4的表達情況。結果顯示，CaSki/NK4表達陽性，CaSki和CaSki/LUC中NK4無表達（圖1）。

2.2 NK4拮抗HGF抑制c-Met磷酸化

Western blot檢測結果顯示，CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4 3種培養(yǎng)基上清培養(yǎng)的CaSki細胞裂解液中，c-Met均為陽性，CaSki/NK4培養(yǎng)基培養(yǎng)的CaSki細胞裂解液中c-Met及其活化后產(chǎn)物p-Met陰性，其余2種細胞裂解液中則為陽性（圖2）。

2.3 細胞體外生長曲線測定

CaSki/NK4細胞和對照（CaSki，CaSki/LUC）細胞在體外生長速度上無明顯差異（圖3）。

2.4 細胞劃痕實驗

MTT結果顯示，CaSki/NK4劃痕區(qū)域的細胞數(shù)［（2.8±2.0）/mm2］明顯少于CaSki［（33.2±16.2）/mm2］和 CaSki/LUC［（34.3±17.6）/mm2］（圖 4）。

3 討論

HGF 又稱分散因子（scatter factor，SF），是由間質細胞產(chǎn)生的細胞因子。最初因其對肝細胞具有很強的絲裂原作用而命名［8］。HGF與c-Met結合后，c-Met的激酶結構域自動磷酸化，可導致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，逐級將信號放大，最終轉入細胞核，引起一系列生物效應［9］。大量研究表明，HGF/c-Met系統(tǒng)對于腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲、轉移及血管形成具有促進作用。目前針對c-Met信號通路的腫瘤治療主要包括4類：受體/配體拮抗劑，針對酪氨酸激酶催化活性的小分子抑制劑，阻斷受體與其下游效應因子的相互作用及降低細胞表面的c-Met受體數(shù)量。HGF拮抗劑中最具代表性的是NK4，具有拮抗HGF和抑制血管生成的雙重作用［10］。盡管NK4與c-Met受體的親和力僅為HGF的1/8，但NK4與c-Met結合，可以競爭性地完全抑制HGF和c-Met的相互作用。NK4第1個Kringle區(qū)域可抑制細胞增殖，從而引起細胞凋亡；N端競爭性抑制血管生成因子與血管內皮細胞的結合，阻礙血管生成。NK4影響HGF/c-Met系統(tǒng)的信號轉導，但其本身不能誘導c-Met的酪氨酸磷酸化，從而抑制HGF所誘導細胞的增殖、運動和形態(tài)生成作用，從而抑制腫瘤的生長和擴散［11］。

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第2位，僅次于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有50萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國約為10萬，約占全世界的1/4，其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢，且發(fā)病率逐年上升。手術和放療作為宮頸癌最常用的主要治療手段，療效是肯定的。通常情況下，手術用于早期患者，放療多用于中晚期患者。但無論手術技巧和方法的改進還是放療設備和技術的進步都沒有明顯提高宮頸癌的5年生存率。尤其對于晚期患者來說，局部復發(fā)仍舊是一個未解決的難題，因此，尋求手術、放療和化療之外的基因治療和免疫治療方法成為目前提高宮頸癌患者預后的主要研究方向。近期有研究顯示，宮頸癌細胞中c-Met的表達可以作為宮頸癌總生存率的獨立預測指標，對于宮頸癌組織中有c-Met的過度表達的宮頸癌患者需要加大治療強度［12］。因此，探求針對c-Met表達的基因治療方法可以為宮頸癌治療提供一個新方法。從上世紀80年代以來，基因治療就被作為一種可能的通過修飾遺傳過程來治療某一種特定疾病的方法加以研究，1990年進行了首例人體基因治療并獲得基因治療的成功。在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。本研究通過在宮頸癌細胞CaSki中轉染NK4基因表達質粒，研究NK4蛋白表達對宮頸癌細胞生物學行為的影響，發(fā)現(xiàn)成功構建NK4表達CaSki細胞后，NK4蛋白能夠在培養(yǎng)基中大量分泌，且NK4具有抑制c-Met磷酸化的作用。體外實驗結果顯示，在CaSki中轉染NK4和對照質粒對腫瘤細胞體外生長的速度無影響，但能抑制腫瘤細胞體外活動的能力。從而驗證了NK4可通過HGF拮抗劑作用抑制人宮頸癌細胞c-Met受體磷酸化，并能抑制宮頸癌細胞體外活動能力。此結果與文獻報道相一致［13］，為應用NK4進行宮頸癌基因治療提供了研究基礎。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］Date K，Matsumoto K，Shimura H，et al.HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growth factor［J］.FEBS Lett，1997，420（1）：1-6.

［3］Kuba K，Matsumoto K，Date K，et al.HGF/NK4，a four-kringle antagonist of hepatocyte growth factor，is an angiogenesis inhibitor that suppresses tumor growth and metastasis in mice ［J］.Cancer Res，2000，60（23）：6737-6743.

［4］Akira S.Roles of STAT3 defined by tissue-specific gene targeting［J］.Oncogene，2000，19（21）：2607-2611.

［5］Aaronson DS，Horvath CM.A road map for those who don't know JAK-STAT［J］.Science，2002，296（5573）：1653-1655.

［6］Sehgal PB，Kumar V，Guo G，et al.Different patterns of regulation of Tyr-phosphorylated STAT1 and STAT3 in human hepatoma Hep3B cells by the phosphatase inhibitor orthovanadate［J］.Arch Biochem Biophys，2003，412（2）：242-250.

［7］Kato H，Inoue T，Asanoma K，et al.Activation of STAT3/5 signal pathways in complete mole and repression in choriocarcinoma cell lines［J］.J Reprod Med，2006，51（1）：41-48.

［8］Cooper CS，Park M，Blair DG，et al.Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line［J］.Nature，1984，311（5981）：29-33.

［9］Rosario M，Birchmeier W.How to make tubes：signaling by the Met receptor tyrosine kinase［J］.Trends Cell Biol，2003，13 （6）：328-335.

［10］Wen J，Matsumoto K，Taniura N，et al.Inhibition of colon cancer growth and metastasis by NK4 gene repetitive delivery in mice［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，358（1）：117-123.

［11］Matsumoto K，Nakamura T，Sakai K.Hepatocyte growth factor and Met in tumor biology and therapeutic approach with NK4［J］.Proteomics，2008，8（16）：3360-3370.

［12］Tsai HW，Chow NH，Lin CP，et al.The significance of prohibitin and c-Met/hepatocyte growth factor receptor in the progression of cervical adenocarcinoma［J］.Hum Pathol，2006，37（2）：198-204.

［13］Saga Y，Mizukami H，Suzuki M，et al.Expression of HGF/NK4 in ovarian cancer cells suppresses intraperitoneal dissemination and extends host survival［J］.Gene Ther，2001，8（19）：1450-1455.