血管內皮生長因子D在肌肉瘤小鼠模型中的表達

姚立杰，金海峰，馬勇，謝立平

（齊齊哈爾醫學院解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

肌肉瘤是起源于橫紋肌細胞或向橫紋肌細胞分化的間葉細胞的一種惡性腫瘤，為兒童軟組織肉瘤中最常見的一種，少發生于成人，男性較女性多見，其惡性程度較高。橫紋肌肉瘤易發生區域淋巴結轉移和血道轉移，文獻報道區域淋巴轉移率為15%～25%，血道轉移率可超過50%，而腫瘤的生長、侵襲和轉移依賴于血管和淋巴管的生成。近年的研究表明，血管內皮生長因子家族在腫瘤轉移過程中起重要作用，血管內皮生長因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGF-D）是最近發現與淋巴管生成及腫瘤淋巴道轉移有關的因子。本實驗通過用S180肉瘤小鼠癌性腹水在小鼠臀部肌層種植，獲得穩定的S180肉瘤動物模型［1］，用淋巴管內皮透明質酸受體 1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1）作為淋巴管標記物［2］，觀察橫紋肌肉瘤中VEGF-D促進淋巴管生成的作用，為臨床抗淋巴管生成、治療腫瘤提供有效的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、腫瘤細胞及主要試劑

健康昆明小鼠，雌雄不分，體質量18～20 g，由黑龍江省哈爾濱醫科大學附屬二院動物實驗中心提供。瘤株為S180肉瘤小鼠腹水型，由黑龍江省腫瘤防治研究所提供，經小鼠腹腔接種傳代接種并于-70℃冰箱凍存備用。LYVE-1（H-156）多克隆抗體和VEGF-D（X142）單克隆抗體（Santa Cruz公司），DouSP免疫組化雙染試劑盒和多聚賴氨酸（福州邁新生物技術開發有限公司），SuperECL Plus超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2 動物模型的制備和標本處理

取S180荷腹水瘤小鼠，消毒腹部，無菌抽取腹腔液。在每只健康小鼠左下肢外側臀部肌層和內側肌層分別注射0.2 mL癌性腹水，共注射30只。接種1周后，可見明顯腫物形成。接種第1周后處死小鼠，取腫瘤組織與瘤周組織（作為對照），常規石蠟包埋切片，HE染色，觀察腫瘤及瘤周組織淋巴管和血管。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色檢測小鼠肉瘤組織中VEGF-D的表達：待測的新鮮組織浸入4%多聚甲醛，4℃冰箱保存，石蠟包埋，常規4 μm連續切片，阻斷內源性過氧化物酶的活性，滴加一抗（VEGF-D濃度 1∶400，LYVE-1濃度 1∶600），濕盒中孵育，4℃過夜，滴加即用型生物素化二抗，其余嚴格按試劑盒說明書操作。光鏡下觀察結果。結果判斷：陽性顯色為藍黑色。每張切片計數3個高倍視野（×400），每個視野計數100個細胞，結果取均數表示。以陽性細胞數>25%為陽性判斷標準。

1.3.2 Western blot檢測小鼠肉瘤組織中VEGF-D的表達：檢測小鼠肌肉瘤組織中VEGF-D及LYVE-1表達。取待測新鮮組織（包括肌肉瘤組織、瘤周組織、対側正常組織）50 mg，用組織小剪刀剪碎（在冰盒中操作），加入適量的細胞裂解液，超聲粉碎，離心，用Lowry法測蛋白總量。加樣15～20 μL，進行SDSPAGE凝膠電泳；轉膜（70 V，1.5 h）；用麗春紅染色，2～3 min后用1×TBS沖洗，分清條帶，做好標記，雜交；滴加一抗（1∶400）孵育，4℃過夜；滴加二抗（1∶5 000）孵育，搖床 2 h；暗室內 ECL反應（避光），X線片顯影，定影；掃描蛋白印跡條帶。

1.4 統計學處理

所有數據均用SPSS 10.0統計軟件處理，計量資料用±s表示，組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察

接種癌性腹水的小鼠，接種后第5天可觸及腫塊，1周后腫塊明顯變大，且與皮膚與深部組織發生粘連，無真正包膜，切面較松軟，灰白或灰紅色魚肉樣。成瘤率100%。

2.2 HE染色后光鏡下觀察

鏡下可見瘤體周圍正常橫紋肌組織被瘤細胞破壞，較多管狀結構散在其中。細胞呈梭形、星形、卵圓或橢圓形，排列稀疏，有豐富的黏液基質，核分裂較多?？梢娍v行的肌原纖維或橫紋（圖1）。

2.3 免疫組化染色切片觀察

VEGF-D主要表達在肌肉瘤組織，在癌巢周圍的微脈管中也可見其陽性表達（經LYVE-1染色證實主要是微淋巴管），見圖2。30例肌肉瘤小鼠模型中后肢內、外側的肌肉瘤組織中VEGF-D的陽性表達（19例）明顯高于后肢內側（11例）、外側（8例）的瘤周組織（P<0.01）；后肢內、外側的瘤周組織比較VEGF-D表達的差異無統計學意義（P＞0.05）。非腫瘤種植側正常橫紋肌組織無VEGF-D表達（圖3）。

2.4 Western blot檢測VEGF-D的表達

Western blot分析顯示，30例肌肉瘤小鼠模型中肌肉瘤組織VEGF-D的表達（VEGF-D/β-actin光密度比值 1.903 6±0.045 3）明顯高于后肢內側（VEGF-D/β-actin 光密度比值 0.578 9±0.043 6）、外側（VEGF-D/β-actin光密度比值 0.620 4±0.109 9）的瘤周組織（P<0.05），后肢內、外側的瘤周組織比較，VEGF-D表達的差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

3 討論

在小動物腫瘤模型的研究中，S180肉瘤建株最初應用于腹水腫瘤模型的研究，隨后作為移植性肉瘤模型逐漸在NH（昆明）小鼠、Balb/C小鼠、ICR小鼠等各品系小鼠中得到應用，說明S180肉瘤種系差異小，適應性廣。本實驗選擇S180肉瘤小鼠癌性腹水，在小鼠臀部肌層種植，獲得穩定的S180橫紋肌肉瘤動物模型。觀察其生長規律，結果表明該動物模型復制方法簡單，成功率高，性質穩定，實驗周期短，可控性好，是理想的小動物肉瘤實驗模型［1］。

VEGF-D是1996年首先由Orlandini等從鼠的完全缺失c-fos基因的成纖維細胞中分離提取的，1998年由Achen在核酸數據庫中通過基于計算機的同源性搜索，確認了這個VEGF家族中的新成員，并將其命名VEGF-D［3］。LYVE-1只表達在淋巴管內皮上，在血管內皮、腫瘤細胞都無表達，作為淋巴管的特異性標記物更為準確。因此本研究中采用了LYVE-1（H-156）多克隆抗體對橫紋肌肉瘤組織內的淋巴管進行標記，結果顯示，標記的管腔多呈擴張狀，形態不規則，壁薄，管腔內未見紅細胞，也有呈閉鎖的條索狀或幾個內皮細胞構成的細胞簇，甚至單個內皮細胞。通過對30例橫紋肌肉瘤組織內淋巴管分布部位的觀察，橫紋肌肉瘤組織中心區和邊緣區均存在淋巴管，淋巴管的數量明顯增加，這預示著橫紋肌肉瘤組織中存在淋巴管的增生和新生，淋巴管的增生和新生可能與VEGF-D的誘導密切相關。本研究結果表明，VEGF-D是促進橫紋肌肉瘤淋巴道轉移的重要因素之一，相信隨著對VEGF家族研究的深入，將為腫瘤的抗轉移治療進而提高患者的生存率開辟新的方向［4，5］。

［1］湯宇，崔雪梅，袁玫，等.小鼠移植性S180肉瘤模型的建立及溫和加熱對熱休克蛋白70表達的影響［J］.中國矯形外科雜志，2004，12（10）：768-770.

［2］張衛東，趙玲輝，張雅芳，等.胃癌組織淋巴管LYVE-1、鈣粘蛋白的表達及其與癌轉移的關系［J］.中國臨床解剖學雜志，2006，24（2）：170-172.

［3］劉寶全，張雅芳，馬晶，等.血管內皮生長因子D和血管內皮生長因子受體3在人結腸癌中的表達及淋巴道轉移中的作用［J］.解剖學報，2007，38（1）：56-60.

［4］Lee YK，Shanafelt TD，Bone ND，et al.VEGF receptors on chronic lymphocytic leukemia（CLL）B cells interact with STAT 1 and 3：implication for apoptosis resistance［J］.Leukemia，2005，19（4）：513-523.

［5］Jia H，Bagherzadeh A，Hartzoulakis B，et al.Characterization of a bicyclic peptide neuropilin（NP-1）antagonist（EG3287）reveals importance of vascular endothelial growth factor exon 8 for NP-1 binding and role of NP-1 in KDR signaling ［J］.Biol Chem，2006，281（19）：13493-13502.