脾虛發熱證大鼠模型的研究

劉進娜，謝 鳴△，高秀蘭，趙榮華

(1．北京中醫藥大學國家重點方劑學學科，北京 100029;2．山東省中醫藥高等?？茖W校，山東 煙臺 264100)

脾虛發熱證大鼠模型的研究

劉進娜1，謝 鳴1△，高秀蘭2，趙榮華1

(1．北京中醫藥大學國家重點方劑學學科，北京 100029;2．山東省中醫藥高等?？茖W校，山東 煙臺 264100)

目的:復制并評價脾虛發熱大鼠模型。方法:大鼠隨機分為正常對照組、單純脾虛組、脾虛發熱組。大鼠采用飲食失節+過度疲勞法復制脾虛模型，于造模第22天腹腔注射LPS(80μg/kg)誘導發熱，測定各時間點的肛溫、體重、外觀行為變化積分值、尿D-木糖排泄率和外周血相關指標。結果:①與正常對照組比較，脾虛發熱組大鼠體溫除在30min有一過性降低外，其余各觀察點均呈顯著性升高(P＜0．01，P＜0．05);單純脾虛組大鼠體溫除在60min時有一過性升高外，其余各點無顯著性差異;脾虛發熱組與單純脾虛組大鼠在第1、2、3周末的體重均明顯降低;第2、3周末的外觀行為變化總積分值呈顯著性增加(P＜0．05，P＜0.01);第 3 周末的尿 D-木糖排泄率、血 GAS、MTL、IL-1β、IL-2、T3、T4、TSH 均降低，IL-6 和 SS 升高(P ＜0．05，P ＜0．01);②與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫一直呈顯著性升高(P＜0．01);外周血T4含量顯著性降低(P＜0．01)，其余各指標的差異無顯著性。結論:飲食失節+過度疲勞+LPS注射可引起大鼠出現類中醫脾虛發熱證。

脾虛;脾虛發熱;證候模型

脾虛發熱是中醫脾虛證中的一個特別類型，以脾虛同時伴有發熱見癥為特點?；谥嗅t證候模型復制的基本要求和中醫病因及發病學理論，本研究擬在以往工作基礎上，參考脾虛發熱的“氣虛邪郁”機理，采用“飲食勞倦+過度疲勞法 +LPS注射”方法復制脾虛發熱大鼠模型。本文報告了該模型的復制及其評價。

1 材料

1．1 動物

雄性Wistar鼠200g～220g，購于北京市維通利華實驗動物技術有限公司(動物許可證號 SCXK(京)2006～0009)。

1．2 試劑

LPS注射液的制備:脂多糖(Escherichia coli endotoxin 055B5，L2880，LPS)，Sigma 公司生產。無菌條件下，用生理鹽水將 LPS配成濃度為20μg/ml的LPS注射液，備用。D-木糖:Sigma公司生產(生產批號 C5H10O5)。GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH、MTL、SS試劑盒由北京華英生物技術研究所提供(生產批號20101106)。

1．3 儀器

電腦數字溫度計MC-3B型:OMROM歐姆龍(大連)有限公司生產;塑料鋼化筒:執行標準:Q/WHC02-2002;r-911全自動放免計數儀:中國科技大學實業總公司生產。

2 方法

2．1 制模方法

采用飲食失節+過度疲勞復制脾虛+LPS腹腔注射誘導發熱［1］的復合方法。實驗前全部動物進行預游泳篩選，剔除游泳時間少于 10min、大于20min的大鼠。符合上述條件的大鼠每天 PM 2∶00置于盛有溫水 22℃ ±1℃的塑料鋼化桶中游泳10min，每次3只，有抱團現象即刻輕輕使之分開;隔日喂食(隔日禁食，隔日足量給食)，連續3周復制脾虛模型。于實驗第22天AM 8∶00給予大鼠一次性腹腔注射LPS(80μg/kg)誘導脾虛發熱。

2．2 分組處理

大鼠隨機分為正常對照組、單純脾虛組、脾虛發熱組共3組，每組10只。單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠按上述脾虛證制模方法，連續3周。正常對照組給予等量生理鹽水。于造模第22天的上午8∶00，脾虛發熱組大鼠腹腔一次性注射 LPS(80μg/kg)誘發動物發熱，單純脾虛和正常對照組大鼠注射等量生理鹽水。

2．3 指標測定

實驗期間，每周測量體重和體溫各1次，并觀察記錄其外觀行為變化，統計各組變化分值。第21天各組大鼠灌服10%D-木糖溶液5ml，于代謝籠中收集大鼠5h的尿液，用簡苯三酚法測定 D-木糖排泄率(即尿液中排出的劑量與所灌入胃內總劑量的比率)。于造模第22天測定各組大鼠腹腔注射后30min、60min、120min、180min、240min、330min 的肛溫，繪制各組平均體溫曲線。隨后即刻腹腔注射10%水合氯醛(0．35ml/100g體重)麻醉，腹主動脈取血6ml，其中 3ml室溫放置，2500rpm 15min取血清;3mL于管中預置的10%EDTA·Na230μl和抑肽酶40μl充分混勻，2000rpm 10min取血漿，血清和血漿于冰箱-20℃保存。放免試劑盒法測定 GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、T3、T4、TSH 和 MTL、SS。

2．4 統計方法

3 結果

3．1 各組大鼠的體溫變化

表1圖1顯示，與正常對照組比較，脾虛發熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫顯著升高，其中在 60min、120min、180min、240min 時的差異均有顯著性(P ＜0．01，P ＜0．05);單純脾虛組大鼠的體溫在60min時有一過性升高，差異有非常顯著性(P＜0．01)，之后體溫變化不大，各點體溫差異均無顯著性(P＞0.05)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠體溫在30min時有一過性降低，之后體溫明顯升高，其中120min、180min、240min時的差異均有顯著性(P ＜0．01)。

圖1顯示，除正常對照組大鼠于注射后30min時有一過性小幅升高外，其余時間點的體溫變化不大。與正常對照組相比，單純脾虛組大鼠體溫在60min時有一過性升高并出現峰值，之后下降并趨于平穩，其60min～180min時段的體溫曲線下移;脾虛發熱組體溫在30min時一過性下降，之后體溫逐漸升高，180min時出現峰值，之后有所下降，60min～330min時段的體溫曲線上抬。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠體溫 60min時升高，60min～180min的體溫曲線明顯上抬。

表1 各組大鼠不同時間點的△T變化(±s，n=10)

表1 各組大鼠不同時間點的△T變化(±s，n=10)

注:正常對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與單純脾虛組比較:▲▲ P ＜0．01

組 別 例數不同時間點的△T/min 30 60 120 180 240 330正常對照組 10 0．24 ±0．50 －0．07 ±0．39 0．07 ±0．41 0．19 ±0．390．03 ±0．35 0．00 ± 0．46單純脾虛組 10 －0．08±0．67 0．37±0．20＊＊ －0．19 ±0．27 －0．15±0．34 －0．40±0．45 －0．20±0．44脾虛發熱組 10 －0．46 ±0．60* 0．56 ±0．24＊＊ 0．38 ±0．47＊▲▲ 1．36 ±0．61＊＊▲▲ 0．49 ±0．27＊＊▲▲0．11 ± 0．37

圖1 各組大鼠不同時間點的△T變化曲線

3．2 各組大鼠體重和外觀表征的變化

3．2．1 體重變化 表2顯示，正常對照組大鼠體重隨時間不斷明顯增加，脾虛發熱組與單純脾虛組大鼠體重增加較為緩慢，在第3周末均未見增加。與正常對照組比較，脾虛發熱組與單純脾虛組大鼠在第1、2、3周末的體重均明顯降低，差異均有顯著性(P＜0．05，P＜0.01)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠各點的體重無明顯變化，差異均無顯著性(P ＞0．05)。

3．2．2 行為學變化 表3顯示，造模1周后各組大鼠外觀行為均未有明顯變化，各組總積分差異均無顯著性(P＞0．05)。較之正常對照組，實驗第2周單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠開始表現出活動減少、喜扎堆、飲食減少、皮毛不順、大便溏薄等;第3周出現動作遲緩、神情怠、毛發不澤、倦臥等變化，其外觀行為變化總積分均見明顯升高，差異均有顯著性(P＜0．01);單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠外觀行為變化總積分的差異均無顯著性(P＞0．05)。

表2 各組大鼠體重變化(±s，n=10)

表2 各組大鼠體重變化(±s，n=10)

注:與正常對照組比較:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數造模不同時間點的體重(g)0周 1周 2周 3周正常對照組 10 190．96 ±6．87 237．62 ±10．80 288．71 ±12．93 318．04 ±17．16單純脾虛組 10 193．01±7．60 220．07 ± 8．39* 231．30 ± 5．41＊＊ 231．29± 7．96＊＊脾虛發熱組 10 195．29±7．08 220．97 ± 8．38* 227．30 ± 5．42＊＊ 228．23± 6．49＊＊

表3 各組大鼠不同時間點外觀行為總積分(±s，n=10)

表3 各組大鼠不同時間點外觀行為總積分(±s，n=10)

注:與正常對照組比較:＊＊P ＜0．01

組 別 外觀行為變化總積分第1周末 第2周末 第3周末正常對照組0．18 ± 0．07 0．20 ±0．13 0．21 ±0．15單純脾虛組 0．33 ±0．25 1．15 ±0．50＊＊ 1．45 ±0．65＊＊脾虛發熱組 0．31 ±0．20 1．10 ±0．45＊＊ 1．35 ±0．39＊＊

3．3 各組大鼠與脾虛相關指標的變化

3．3．1 尿 D-木糖排泄率的變化 表4顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠尿D-木糖排泄率均降低，差異有顯著性(P＜0．05，P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠尿D-木糖排泄率無明顯變化(P＞0.05)。

3．3．2 血中胃腸激素含量的變化 表5顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠外周血GAS、MTL含量均明顯降低，SS含量升高，差異均有顯著性(P＜0．01，P＜0.05)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠外周血 GAS、MTL和SS含量均無明顯變化(P＞0.05)。

3．3．3 血中代謝調節激素的變化 表6顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠外周血T3、T4、TSH含量均見降低，差異均有顯著性(P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠外周血T3、TSH含量無明顯差異(P＞0.05)，但 T4含量降低，差異有顯著性(P＜0．01)。

3．3．4 血中免疫因子的變化 表7顯示，與正常對照組相比，單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠外周血IL-1β、IL-2含量降低，血 IL-6含量升高，差異均有顯著性(P＜0.05，P＜0．01)。與單純脾虛組相比，脾虛發熱組大鼠外周血 IL-1β、IL-2和IL-6含量均無明顯差異(P＞0.05)。

表4 各組大鼠尿D－木糖排泄率的變化(±s)

表4 各組大鼠尿D－木糖排泄率的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數 D 木糖排泄率正常對照組10 23．84 ± 0．50單純脾虛組 10 19．65 ±4．18＊＊脾虛發熱組 10 20．22 ±5．42*

4 討論

脾虛發熱是中醫脾虛證中的一個特別證型，有關該模型復制的研究比較少。之前，張麗萍等［2、3］采用饑餓法(動物禁食7d)造成兔氣虛模型，再給予耳緣靜脈注射傷寒、副傷寒三聯疫苗0．5ml/kg誘導氣虛發熱模型，并觀察到補中益氣湯不同劑量及其拆方對該模型均有不同的退熱作用。劉瑜彬等［4］以大鼠ΔT和體重為觀察指標，采用游泳勞損 +食量限制+注射LPS復制大鼠氣虛發熱模型，并觀察了補中益氣湯高、中、低劑量對模型體溫的影響。這兩篇報道均以發熱為重點，對模型涉及脾虛的特性僅限于動物一般外觀行為上的描述，缺乏實驗室相關指標的支持，作為脾虛或氣虛發熱的模型仍有待評價。

表5 各組大鼠外周血中胃腸激素的變化(±s)

表5 各組大鼠外周血中胃腸激素的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數 外周血中的胃腸激素含量GAS(pg/ml) MTL(pg/ml) SS(pg/ml)正常對照組9 69．57 ±13．78 438．17 ±52．26 231．72 ± 9．95單純脾虛組 9 55．84 ± 7．85＊＊ 384．44 ±23．41* 265．34 ±37．61*脾虛發熱組 9 55．44 ± 6．91＊＊ 359．27 ±33．00＊＊ 260．23 ±41．11*

表6 各組大鼠外周血相關物質代謝指標的變化

表7 各組大鼠外周血中免疫因子的變化(±s)

表7 各組大鼠外周血中免疫因子的變化(±s)

注:與正常對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01

組 別 例數 外周血中的相關介質IL-1β(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-6(pg/ml)正常對照組9 0．69 ± 0．05 7．43 ± 1．83 153．05 ± 41．57單純脾虛組 9 0．23 ±0．02* 5．60 ±1．65* 200．96 ±62．95*脾虛發熱組 9 0．29 ±0．02* 5．40 ±0．82＊＊ 228．64 ±28．60＊＊

之前本學科曾根據中醫“饑飽失常、腸胃乃傷”和“勞則傷脾”的中醫發病學理論，采用飲食失節+過度疲勞法，成功復制出脾虛證大鼠模型［5］。在探討小柴胡湯及其不同配伍與效用關系的研究中，曾應用小劑量LPS腹腔注射成功誘導出大鼠發熱模型［6、7］。本次則根據中醫脾虛發熱證的脾虛 +發熱的臨床特征，結合有關脾虛發熱機制認識中的“氣虛邪郁”［8］以及 LPS作為外源性致熱源的特性，提出“飲食失節 +過度疲勞 +外邪復感”的脾虛發熱機制，采用“間隔斷食+游泳疲勞 +腹注 LPS”的方法來復制脾虛發熱模型。

目前中醫脾虛證模型復制的方法較多，但有關模型的評價學界尚未有公認統一的評判標準。通常，如能同時滿足在模型復制思路或方法上盡可能符合中醫病因及發病學經驗、模型動物比較好地表現出類似中醫臨床癥狀、出現與中醫證密切相關的現代生理病理改變(相關實驗室指標)這樣一些條件應該是可以得到多數人認同的?；谶@種考慮，本模型復制研究中設立了包括體重變化在內的外觀表征、與脾虛相關的實驗室指標及發熱等多組指標群以能全面評估模型的系統特征。其中對與中醫癥征密切相關的動物外觀行為的觀察，在以往定性描述的基礎上，引入各行為分值及表征變化總積分值的半定量方法來提高判斷的客觀準確性。實驗室指標的選定則是根據中醫脾主運化、為氣血生化之源及氣主衛外功能，參考了目前有關脾虛現代研究的部分成果，如與脾虛相關的胃腸功能(血GAS、MTL和 SS 及尿 D-木糖排泄率)［9、10］、物質代謝(血 T3、T4、TSH)［11、12］及 免 疫 功 能 (血 IL-1β、IL-2、IL-6)［13、14］等多組指標以作為該模型評定的佐證。

本實驗觀察到，單純脾虛組和脾虛發熱組大鼠于實驗第2周開始表現出活動減少、喜扎堆、飲少便溏、皮毛不順澤等外觀變化，實驗第3周進一步出現明顯的動作遲緩、倦怠倦臥、毛發不澤等表現，外觀行為變化積分值和體重分別出現明顯的升高和降低。同時反映胃腸功能的血GAS、MTL和尿D-木糖排泄率明顯降低;反映機體代謝水平的血 T3、T4及TSH含量以及反映免疫(防御)功能狀態的血 IL-1β、IL-2含量均見降低，與之前的研究結果［6］相一致。結果再次表明，采用飲食不節加游泳疲勞的方法可以穩定誘導出大鼠的中醫脾虛證。實驗還觀察到，單純脾虛模組大鼠按80μg/kg劑量一次性腹腔注射LPS 30min后出現體溫升高，持續升高的體溫超過6h。綜合大鼠外觀行為、脾虛相關實驗室指標及發熱等多組指標的變化，可以判斷該模型大鼠的確具有中醫脾虛發熱證的特征。結論為采用飲食不節+游泳疲勞與注射LPS方法可誘導出大鼠脾虛發熱證模型。

［1］劉進娜，謝 鳴，高秀蘭，等．LPS對正常和脾虛大鼠體溫的影響［J］．遼寧中醫藥大學學報，2011，13(8):197．

［2］張麗萍，傅貞亮，張登本．補中益氣湯對氣虛邪侵發熱動物體溫的影響［J］．中醫雜志，1998，39(4):236-239．

［3］張恩戶，趙 勤，侯建平，等．補中益氣湯對家兔脾虛發熱模型體溫、腦脊液 PGE2和 PO/AH區組織 cAMP含量的影響［J］．中醫藥學刊，2003，21(9):1529-1552．

［4］劉瑜彬，王 暉，唐曉峰，等．灰關聯聚類法評價補中益氣湯對大鼠氣虛發熱的效果［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(18):124-128．

［5］李艷彥，謝 鳴，陳 禹，等．肝郁脾虛證模型大鼠下丘腦 －垂體－腎上腺皮質的變化．中國生物醫學進展，2006，6(4):10-12．

［6］孫明瑜，高 琳，謝 鳴．小柴胡湯合煎液與分煎合液對 LPS誘導大鼠發熱模型的影響［J］．中國中醫藥信息雜志，2003，10(12):17-19．

［7］田文靜．柴胡透邪退熱功用與其用量、配伍及機體狀態關系研究［D］．北京:北京中醫藥大學，2010．

［8］柴 琳．也談“氣虛發熱”之病機與治療［J］．貴陽中醫學院學報，2008，30(6):49-51．

［9］蔣偉哲，黃雪梅，孔曉龍．龍眼參提取物治療脾虛動物的實驗研究［J］．中國中醫基礎醫學雜志，2002，8(5):37-39．

［10］張 翥，馬繼偉，李寅超．溢尿停對實驗性脾虛SD大鼠胃腸功能的影響［J］．遼寧中醫雜志，2004，31(8):703-704．

［11］章 梅，夏 天，南 耘，等．甲狀腺激素對脾虛小鼠免疫功能的影響［J］．中國中西醫結合雜志，1995，7(基礎理論特集):211-213．

［12］章 梅，夏 天，南 耘，等．甲狀腺激素對脾虛鼠淋巴細胞和胸腺細胞的作用［J］．美國綜合醫學雜志，1999，1(4):217-218．

［13］魏彥明．實驗性脾虛證大鼠免疫細胞因子變化及四君子湯對其影響［J］．畜牧獸醫學報，2001，32(6):530．

［14］王洪海，謝 鳴．復合病因造模法致脾虛證大鼠模型在免疫系統方面的變化［J］．中國實驗方劑學雜志，2006，12(12):28-30．

Research on the rat model of fever due to spleen deficiency syndrome

LIU Jin-na1，XIE Ming1△，GAO Xiu-lan2，ZHAO Rong-hua1
(1．Formulary Department，the national key discipline，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100029，China;2．Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai246100，China)

Objective:To copy and value the model of spleen-qi deficiency with fever．Methods:The rats were assigned into the normal group，spleen-deficiency group，spleen-deficiency with fever group．The rats were treated with excess fatigueout of constant diet to copy spleen-qi deficiency rat model．On the 22th day，The rats of spleen-qi deficiency with fever group were respectivelyipwith LPS(80μg/kg)to induce fever．The rectal temperature was measured．The body weight and change of syndrome and autonomous behavior was observed．D-xylose of urine and peripheral blood GAS，MTL，SS，IL-1β，IL-2，IL-6，T3，T4，TSH are measured．Result:①Compared with the normal group，the rectal temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜ 0．05，P＜0．01);the spleen-qi deficiency group has a transient decrease at 60min，then return to the basic line．The body weight of spleen-qi deficiency and spleen-qi deficiency with fever group were decreased obviously at the end of 3w(P＜0．01)and the integral quantity of appearance behavior change were significantly increased at the weekend of 2w and 3w(P＜0．05，P＜0．01);Urine D-xylose excretion rate，peripheral blood GAS，MTL，IL-1β，IL-2，T3，T4，TSH decreased and IL-6，SS increased(P＜ 0．05，P＜0．01)．②Compared with the spleen-qi deficiency group，temperature of spleen-qi deficiency with fever group has a transient decrease at 30min，then raised obviously(P＜0．01)．Blood T4has decreased obviously(P＜0．01)，other indexes have no significance．Conclusion:By adopting excess fatigue+out of constant diet+LPS injection had induced the rats show a serial of appearance in syndrome model of autonomous behavior，body weight，body temperature which were similar to Chinese symptoms of spleen-qi deficiency with fever．

Spleen-qi deficiency;Spleen-qi deficiency with fever;Syndrome model

R332

B

1006-3250(2012)02-0150-04

劉進娜(1983-)，女，河北邢臺人，醫學碩士，從事方-證相關的研究。

△通訊作者:謝 鳴(1957-)，男，安徽安慶人，教授，博士研究生導師，醫學博士，從事方-證相關研究，Tel:01064286992，E-mail:xieming603@263．net。

2011-09-08