逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性及內質網/SREBP1/脂代謝通路的影響*

薛 欣，李玉梅，李海玉，王 震，張永祥

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性及內質網/SREBP1/脂代謝通路的影響*

薛 欣，李玉梅，李海玉，王 震，張永祥

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

目的:從內質網應激及其調控的與脂質合成相關的SREBP1通路的角度探討逍遙散防治大鼠肝細胞脂肪變性的分子機制。方法:健康Wistar大鼠分為正常對照組、模型組、逍遙散組和東寶肝泰組4組，建立四氯化碳聯合高脂飲食誘導大鼠脂肪肝動物模型，觀察各組肝組織病理變化、血清肝功能、肝組織中膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)含量及肝組織GRP78、SREBP1及生脂相關酶分子的表達。結果:逍遙散組的肝指數(P＜0．01)、血清 ALT(P＜0．01)、AST(P＜0．05)水平及肝組織中 TG(P＜0．05)含量較模型組明顯降低。病理HE染色顯示，逍遙散組肝脂肪變性較模型組明顯減輕;RT-PCR和Western blot結果表明，逍遙散組GRP78分子、SREBP1 mRNA及部分生脂相關酶mRNA的表達低于模型組。結論:逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性的抑制作用與內質網應激有關，其可能分子機制為:逍遙散降低內質網應激，引起轉錄因子SREBP1的表達與入核轉位的減少，在細胞核內被SREBP1激活的生脂相關酶基因的誘導表達降低，使肝細胞內甘油三脂、膽固醇合成減少，導致肝細胞脂肪變性的減輕。

脂肪肝;逍遙散;葡萄糖調節蛋白78(GRP78);固醇調節元件結合蛋白(SREBP)

脂肪肝是由多種疾病和病因引起的肝臟脂肪性改變，是一種代謝性疾病。臨床及科研研究表明，中醫藥在脂肪肝的預防及治療方面有很大的優勢，對于改善癥狀、恢復肝功能都有很好的療效［1］。逍遙散為調和肝脾的要方，具有疏肝解郁、健脾養血的功效。亦有文獻報道，逍遙散加減用于非酒精性脂肪肝的 治 療，療 效 滿 意［2、3］。葡 萄 糖 調 節 蛋 白 78(glucose regulated protein 78，GRP78)是位于內質網的一種分子伴侶蛋白，在應激狀態下大量表達以維持內質網的穩定，被看作是內質網應激的標志蛋白［4］。固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1)是一類位于內質網上的膜連接蛋白，內質網應激時轉錄因子SREBP1表達增加并且轉錄活性受到激活，活化的SREBP1進入核內啟動與脂類合成有關的一些關鍵酶的表達:(1)與膽固醇合成有關的酶:HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶等;(2)與脂肪酸和甘油三脂合成有關的酶:乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、甘油-3-磷酸酰基轉移酶等［5、6］。近年來諸多研究顯示，內質網應激信號通路及其效應與非酒精性脂肪性肝病的關系密切［7］。本研究利用四氯化碳聯合高脂飲食誘導的大鼠脂肪肝動物模型，通過病理學、血清學、組織生化指標的檢測，觀察逍遙散對肝細胞脂肪變性的影響，并采用RT-PCR和Western blot檢測GRP78、SREBP-1c及生脂相關酶的表達，探討內質網應激調控的脂質合成信號通路在逍遙散防治肝細胞脂肪變性中的作用。

1 材料

1．1 動物

清潔級Wistar雄性大鼠29只，體質量180g～230g，由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供(合格證號SCXK(京)2005-0004)，飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所動物實驗中心(為清潔級動物室)。

1．2 藥物和試劑

東寶肝泰片(批號905011CF)購于通化東寶藥業股份有限公司;四氯化碳(CCL4批號20080118)購自北京化學試劑公司;高脂飼料(基礎飼料90%、油8%、膽固醇2%)由北京科澳協力飼料有限公司生產;總膽固醇 CHOD-PAP、甘油三脂 GPO-PAP檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;小鼠抗GRP78單克隆抗體(SPA-827)、α-Tubulin單克隆抗體(T5768)和 HRP標記的羊抗小鼠 IgG分別購自Stressgen、Sigma和 GE公司;一步法總 RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kits和RT逆轉錄試劑盒SuperScriptⅢ(18080-051)分別購自 QIAGEN和Invitrogen公司;實驗中使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．3 藥物制備

逍遙散湯劑制備:柴胡15g，當歸15g，白芍15g，白術 15g，茯苓 15g，生姜 15g，薄荷 6g，炙甘草 6g。所有藥材均購于北京同仁堂藥業股份有限公司，水煎劑濃縮至折合原藥材濃度0．9g/ml(按人60kg的每日1劑用量，計算出臨床等效劑量)。東寶肝泰溶液制備:以相當于60kg體質量成人臨床用藥量10倍的量，將東寶肝泰片劑用蒸餾水溶解制成東寶肝泰溶液。

2 方法

2．1 分組、造模及給藥

將實驗動物按體質量均衡和隨機的原則分為正常對照組(Cont)5只、模型組(Mod)、逍遙散組(XYS)和東寶肝泰組(DBG)各4組8只。模型組及各給藥組大鼠首次以純CCl45ml/kg體質量，以后以40%CCl4-橄欖油溶液3ml/kg體質量，在大鼠背部后側做皮下注射，每周2次共4周，同時以高脂飼料飼養。正常對照組以橄欖油做皮下注射，并給予普通飼料。自造模之日起，逍遙散組給予含生藥0．9g/ml的濃縮液灌胃，東寶肝泰組以相當于60kg體重成人臨床用藥量10倍的量灌胃，各給藥組按1ml/100g體質量灌胃，1次/d，連續給藥4周。正常及模型組給予等體積蒸餾水灌胃。各組大鼠于造模給藥結束后處死，留取肝組織標本及下腔靜脈取血。

2．2 計算肝臟指數

經左心室插管注入冰生理鹽水對肝臟灌流、瀝干水分稱肝重，計算肝臟指數=肝濕重/體質量×100%。

2．3 血清肝功能指標的測定

下腔靜脈取血5ml，室溫靜止，4000r/min離心10min，迅速分離上層血清，－20℃保存。用全自動生化分析儀(日本Olympus 2700)檢測血清中天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)的含量。

2．4 肝組織總膽固醇(TC)、總甘油三脂(TG)含量檢測

以乙醇-丙酮(1∶1)溶液將新鮮肝組織100mg制成 10%肝勻漿，4℃ 放置 48h，3000r/min離心15min分離上清備用，用BCA法測肝組織勻漿中蛋白質含量，肝組織總膽固醇(TC)或總甘油三脂(TG)含量的測定參照試劑盒操作說明，結果均以mmol/g肝重表示。

2．5 肝組織病理學改變的HE染色

取1×1×0．5 cm3大小肝組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝脂肪變程度。

2．6 Western Blot檢測肝組織中 GRP78的蛋白表達

取肝組織100mg加入RIPA裂解液制成勻漿，用低溫離心機離心14000 rpm、5min，取上清-80℃保存，總蛋白提取液中蛋白質含量以BCA法測定。取40ug總蛋白提取液于10%的SDS-PAGE凝膠中進行電泳并轉移至 PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入1∶2000稀釋的 GRP78單抗4℃孵育過夜;TBST洗膜3次，加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，ECL Plus發光顯色，X線底片壓片、顯像。內參為微管蛋白(α-Tubulin)。

2．7 半定量 RT-PCR檢測肝組織中 GRP78、SREBF及生脂相關酶mRNA的表達

取肝組織100mg按照RNeasy Mini Kits說明書提取總RNA，用紫外分光光度計定量，按照RT逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA的逆轉錄，并以其為模板擴增 GRP78、SREBF、異戊烯焦磷酸異構酶(IPPiso)、HMGCoA 還原酶 (HMGConA R)、乙酰CoA羧化酶(ACoAC)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)。各目的基因引物序列及PCR產物大小如表1。反應條件略有不同，PCR反應產物經過瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統觀察拍照。

表1 各目的基因的引物序列及PCR產物大小

2．8 統計學方法

采用SPSS 11．0 for windows軟件包進行數據統計學分析，計量資料用±s表示，采用t檢驗，以P＜0．05為有統計學意義。

3 結果

3．1 各組大鼠血清中 ALT、AST水平的變化

表2顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST水平明顯高于正常組(P＜0．01)，與模型組相比較，逍遙散組及東寶肝泰組血清中ALT、AST水平明顯降低(P＜0．05)，表明逍遙散及東寶肝泰均能有效保護肝細胞，維持肝臟的功能。

表2 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較(±s)

表2 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0．01;與模型組比較:#P＜0．05，##P＜0.01

組別 ALT(U/L) AST(U/L)正 常 組95．0 ± 9．1 280．8 ± 39．30模 型 組 1282．5 ±506．5＊＊ 980．6 ±402．25＊＊逍 遙 散 組 455．5 ±221．2## 430．9 ±121．90#東 寶 肝 泰 組 477．1 ±147．0## 397．9 ± 74．26#

3．2 各組大鼠肝臟病理形態學變化的HE染色(圖1)

正常組:光鏡下肝小葉結構正常，以中央靜脈為中心細胞索排列整齊，肝竇正常，肝細胞核圓位于中央結構清晰，胞質豐富，無明顯病變。

模型組:肝小葉難辨認，肝索紊亂，肝細胞腫脹胞漿疏松，核被擠向邊緣，胞漿內有大小不等的空泡，以小泡性為主;匯管區和中央靜脈周圍出現明顯炎性細胞浸潤，并可見大量肝細胞壞死，脂變肝細胞占肝小葉的50%以上。

給藥組:逍遙散組、東寶肝泰組大鼠脂肪變性程度明顯減輕，肝小葉結構大致正常，部分肝細胞索排列紊亂，肝細胞內脂滴數量減少，炎性細胞浸潤減輕，偶見散在的點狀壞死灶。脂變肝細胞占肝小葉的30%左右。

圖1 各組大鼠肝組織脂肪變性(HE染色×200)

3．3 各組大鼠肝指數、肝組織中 TC、TG含量的變化

表3顯示，模型組肝指數顯著高于正常組(P＜0．01)，逍遙散組及東寶肝泰組較模型組明顯降低(P＜0.05);與正常組大鼠相比，模型組大鼠肝組織中TG含量略有升高(P＜0．05);逍遙散組的肝組織TG略低于模型組(P＜0．05);東寶肝泰組的肝組織TG含量較模型組有下降趨勢，但無統計學差異。與正常組大鼠相比，模型組大鼠肝組織TC含量略有升高，但無統計學差異(P＞0．05)。逍遙散組及東寶肝泰組的肝組織TC含量較模型組有下降趨勢，但無統計學差異(P＞0．05)。

表3 各組大鼠肝組織中TC、TG含量的變化(±s)

表3 各組大鼠肝組織中TC、TG含量的變化(±s)

注:與正常組比較:*P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;與模型組比較:#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 肝指數 TC(mmol/g) TG(mmol/g)正 常 組3．33 ±0．19 1．56 ±0．07 2．96 ±0．33模 型 組 6．36 ±0．81＊＊ 1．93 ±0．19 4．56 ±0．50*逍 遙 散 組 5．22 ±0．66## 1．66 ±0．13 3．83 ±0．10#東 寶 肝 泰 組 5．23 ±0．59##1．81 ±0．12 3．90 ±0．29

3．4 各組大鼠肝組織中GRP78表達的變化

圖2、3顯示，在蛋白及 mRNA水平，模型組大鼠肝組織GRP78的表達均明顯高于正常對照組，東寶肝泰組及逍遙散組GRP78的表達較模型組明顯降低。GRP78是內質網應激的標志性蛋白，說明逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性的抑制作用與內質網應激有關。

圖2 各組大鼠肝組織中GRP78蛋白表達

圖3 各組大鼠肝組織中GRP78mRNA表達

3．5 各組大鼠肝組織中 SREBP-1 mRNA表達的變化

與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠肝組織SREBP-1c mRNA表達顯著增加，逍遙散組及東寶肝泰組SREBP-1 mRNA表達顯著低于模型組(見圖4)，說明逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性的抑制作用亦與SREBP-1有關。

圖4 各組大鼠肝組織中SREBP-1c mRNA表達

3．6 各組大鼠肝組織中生脂相關酶mRNA表達的變化

圖5顯示，異戊烯焦磷酸異構酶(IPPiso)、HMGCoA還原酶(HMGConA R)、乙酰 CoA羧化酶(ACoAC)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)是膽固醇、甘油三脂等脂質合成過程中的關鍵酶。RT-PCR結果表明，模型組大鼠肝組織中生脂相關酶mRNA的表達較正常對照組有不同程度的增高，其中HMGConA還原酶、異戊烯焦磷酸異構酶(IPPiso)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)增高較明顯。逍遙散組對HMGConA、IPPiso和GPAT抑制作用較為明顯。

圖5 各組大鼠肝組織中生脂相關酶mRNA表達

4 討論

脂肪肝在中醫學上歸屬于脅痛、積聚等范疇，多因飲食不節、過逸少勞、飲酒過度、情志神傷、感受濕熱疫毒等所致肝疏泄失職，脾運化無權，水濕內停，痰濁郁結、瘀血阻滯而形成濕濁痰瘀互結、痹阻肝脈遂生本病。其病位在肝，但與脾胃關系密切，肝郁脾虛、痰瘀互阻是其病機關鍵，故治療上側重于疏肝運脾、祛痰活血。逍遙散首載于《太平惠民和劑局方》，為調肝理脾要方，由柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、生姜、薄荷、炙甘草8味中藥組成。方中柴胡疏肝解郁，當歸、白芍養血活血柔肝，白術健脾燥濕同柴胡助脾氣之升，同茯苓助健脾滲濕化痰，薄荷辛涼助柴胡以疏肝氣、解郁熱。諸藥相配，既疏肝健脾又有一定祛痰活血之功。這與脂肪肝的肝郁脾虛失運、痰瘀互結的主要病機相吻合。文中病理結果亦提示，逍遙散在緩解肝細胞脂肪變性方面有一定的療效。

葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated p rotein，GRP78)與熱休克蛋白70(Hsp70)家族具有高度同源性［8］。GRP78分子主要分布于細胞內質網中，參與內質網相關的多種生物學過程:內質網腔內蛋白合成的質控、未折疊蛋白反應調控、啟動內質網應激性細胞凋亡以及內質網鈣穩態的調節等。在內質網功能異常(內質網應激)時GRP78大量表達以維持內質網的穩定，因此GRP78被認為是內質網應激的標志蛋白［4］。RT-PCR和 Western blot顯示，模型組大鼠肝組織GRP78mRNA及蛋白表達顯著高于正常對照組，提示四氯化碳結合高脂飲食引起的肝細胞脂肪變性過程中誘導了內質網應激，逍遙散對其表達具有明顯的抑制作用，說明逍遙散對大鼠肝細胞脂肪變性的抑制作用與內質網應激有關。

由各種因素引起的內質網應激可通過固醇調節的級聯反應調節脂肪的合成，內質網膜含有固醇調節元件結合蛋白(SREBP)和SREBP裂解激活蛋白(SCAP)。ER應激時，膽固醇被消耗，SREBP被激活并與SCAP形成復合物，在高爾基體內SREBP分別被S1、S2蛋白酶裂解，釋放出的氨基末端片段進入核內與其靶基因啟動子的固醇調節元件結合，激活與膽固醇和脂肪酸合成相關基因的轉錄［9、10］。與膽固醇合成有關的酶有HMG-CoA合成酶、HMGCoA還原酶(HMGConA R)等;與脂肪酸和甘油三脂合成有關的酶有乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，FAS)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT);與多不飽和脂肪酸合成有關的酶有 Δ5-脫氫酶;與還原型輔酶合成有關的酶有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等［5］，這些酶在甘油三脂、膽固醇合成過程中起著重要的限速作用［11］。本次實驗結果發現，與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠肝組織 SREBP-1mRNA表達增加的同時，生脂相關酶、HMGConA還原酶、異戊烯焦磷酸異構酶(IPPiso)、甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)、乙酰 CoA羧化酶(ACoAC)mRNA的表達均有不同程度的增高。逍遙散對SREBP-1及生脂相關酶的表達具有不同程度的抑制作用。因此，逍遙散對由四氯化碳聯合高脂飲食引起的肝細胞脂肪變性的抑制作用是通過內質網應激→SREBP1/SCAP→生脂相關酶途徑，調控肝細胞內甘油三脂、膽固醇的合成，調節肝細胞脂肪變性的程度。

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Effects of Xiaoyao San on Hepatic steatosis and ER Stress/SREBP1/lipid metabolism pathway in rats

XUE Xin，LI Yu-mei，LI Hai-yu，WANG Zhen，ZHANG Yong-xiang
(Institute of Basic Theory of TCM，China Academy of TCM，Beijing100700，China)

Objective:Through ER stress/SREBP signaling pathway to investigate experimental efficiency and potential mechanisms of Xiaoyao San(XYS)in preventing fatty degeneration of liver cells in rat．Methods:Healthy Wister rats were randomly divided into 4 groups:normal group，model group，XYS group and Dong Bao Gan Tai(DBGT)group．Hepatic steatosis rats were established by carbon tetrachloride(CCL4)subcutaneous injection along with high-fat diet．The followings were detected:pathological changes of liver，liver function，the levels of total cholesterol(TC)or triglyceride(TG)and the expression of GRP78 protein and mRNA，SREBP1mRNA and lipogenic enzymes mRNA in liver tissues．Result:The liver index(P＜ 0．01)，levels of serum alanine aminotransferase(ALT)(P＜ 0．01)and aspartate aminotransferase(AST)(P＜0．05)and the levels of triglyceride(TG)(P＜0．05)in Xiaoyao San-treated rats were significantly decreased than those in model group．The histopathological changes of hepatic steatosis were more notably improved in XYS– treated group than in model group．The expression of GRP78 protein and mRNA，SREBP1 mRNA and parts of lipogenic enzymes mRNA in liver tissues were reduced in XYS group than in model group．Conclusion:Xiaoyao San preventing hepatic steatosis induced by CCL4－is associated with endoplasmic reticulum stress(ER Stress)．Potential mechanism is that Xiaoyao San prevents the ER Stress and subsequently decreases translocation and binding of SREBP1 to promoter regions of lipogenic genes which is responsible for triglyeride/cholesterol biosynthesis and accumulation．

fatty liver;Xiaoyao San;glucose regulated protein 78;SREBP1

R285．5

B

1006-3250(2012)02-0154-04

中國中醫科學院基本科研業務費自主選題項目(ZZ2006015)

2011-09-11