壯骨止痛方治療大鼠去卵巢骨質疏松癥的蛋白質組學分析*

楊 軍，莫新民△，李勁平

(1．湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410007;2．中南大學，長沙 410208)

壯骨止痛方治療大鼠去卵巢骨質疏松癥的蛋白質組學分析*

楊 軍1，莫新民1△，李勁平2

(1．湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410007;2．中南大學，長沙 410208)

目的:探討壯骨止痛方治療骨質疏松相關蛋白改變譜。方法:利用二維凝膠電泳分離股骨組織的總蛋白，通過軟件分析2-DE圖譜，比較各組間蛋白的表達量，然后利用MALDI-TOF-MS制作差異蛋白點的肽譜，確定各差異蛋白的種類，通過生物信息學分析所得蛋白的功能。結果:壯骨止痛方能調節(jié)骨骼肌的能量代謝、物質轉運，對大鼠去卵巢骨質疏松癥產生調節(jié)作用。

壯骨止痛方;蛋白質組學;骨質疏松癥

△通訊作者:莫新民，男，教授，博士研究生導師，湖南長沙市雨花區(qū)韶山中路113號湖南中醫(yī)藥大學研究生院。

骨質疏松癥(OP)是以骨量減少，骨小梁變細、斷裂、數(shù)量減少，皮質骨多孔、變薄等骨的微觀結構退化為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險性增高的一種全身性骨病［1］，多發(fā)生在絕經(jīng)后婦女、老人和多種慢性疾病患者。雌激素在西醫(yī)臨床治療該病中為主要用藥之一。壯骨止痛方是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)理，在臨床治療該病療效顯著的方藥，為探明其治療途徑以及微觀機理，本實驗采用蛋白組學方法，從分子生物學角度研究該方的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑

1．1．1 實驗動物 SPF級 30只 3月齡雌性SD大鼠，體重250g±10g左右，由湖南省中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(合格證號 SCXK(湘)2009-0004)，購進大鼠后在湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗室進行適應性飼養(yǎng)。

1．1．2 試劑 丙烯酰胺、甲雙叉丙烯酰胺、Tris-base、SDS、巰 基 乙 醇、Triton x-100、Urea、TEMED、過硫酸氨和考馬斯亮藍G-250等購自上海生物工程技術服務有限公司，兩性載體電解質和甘氨酸購自北京經(jīng)科試劑公司，三氟乙酸(TFA)為日本東京化成工業(yè)株式會社產品，碘乙酰胺購自Sigma公司，乙氰(CAN)為國產色譜純，其他試劑均為國產分析純試劑。

1．1．3 壯骨止痛方藥液 壯骨止痛方全方提取液(由中南大學藥學院按標準流程提取)，灌胃時全方藥物為油相和水相混合物。

1．1．4 主要設備 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜系統(tǒng)(MALDI-TOF-MS)為美國Applied Biosystems公司產品，圓盤電泳槽和高壓穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(北京六一儀器廠產品)、普通臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、低溫高速離心機(Beckman公司)。

1．2 動物造模

SPF級SD雌性大鼠購進后在動物房中適應性飼養(yǎng)3d～5d，隨機分為假手術組、模型組和壯骨止痛方組。術前常規(guī)用 2%戊巴比妥鈉(0．2mL/100g)麻醉動物，模型組動物切除雙側卵巢，假手術組僅進行手術操作，只切除部分脂肪但保留卵巢，術后各組動物用青霉素抗炎治療7d;壯骨止痛方組在消炎7d后開始灌胃(劑量為0．6ml水相 +0．4ml油相/100g)，假手術組和模型組則每天用等量生理鹽水灌胃1次，共灌胃13周。

1．3 大鼠股骨組織蛋白樣品的提取和處理

實驗大鼠在最后1次灌胃后禁食24h，用2%的戊巴比妥鈉(0．2mL/100g)腹腔注射，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術架上，用碘伏消毒手術部位，手術剪剪開腹腔后采集標本，取大鼠左后肢股骨剔除附著的肌肉筋膜，保留骨膜，生理鹽水沖洗后，將骨放入同一陶瓷研缽中進行液氮研磨至粉末狀。取0．5g粉末加入 1ml樣品提取緩沖液，充分混勻，4℃12000g離心 10min，去除不溶性顆粒，取上清液200μl，以1∶10比例加入樣品提取緩沖液，置水浴10min以消化核酸，超聲處理5min進一步裂解核酸，加入終濃度為 80%，4℃預冷丙酮，4℃靜置10min，12000g離心 10min棄上清，用 200ul樣品提取緩沖液重新溶解沉淀，吸取上清液即為提取的組織總蛋白質，移至一干凈的 Eppendrof管中保存至－80℃?zhèn)溆?。另?μl上清液用2D Quant Kit蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度。

1．4 雙向電泳

用pH8-10的兩性電解質配制IEF膠條。第一向預電泳 200V 30min、300V 30min、400V 2h，上樣后電壓400V 12h后調到 600V 6h。另外，用 12．5%SDS-PAGE凝膠上端使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入凝膠電泳蛋白質標準品，排盡氣泡后，用含痕量溴酚藍0．5%的瓊脂糖封頂，待瓊脂糖冷卻凝固后裝入 Ettan DALT垂直電泳槽中。設置Ettan DALT電泳條件為:每膠 2．0(2．5)W 電泳30min后再以每膠10(12)W恒功率電泳，直至溴酚藍指示線到達凝膠底邊處1cm處停止電泳。第二向電泳總時間約需用6h左右，電泳結束后用考馬斯亮藍 G-250染色。使用 ImageScanner 2D Platinum 6．0圖像分析軟件，對凝膠進行系統(tǒng)掃描做圖像分析。

1．5 質譜樣品的制備

比較3組雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，從膠上切下，切成 1mm3大小置于 0．5ml的 Eppendorf管中，先后進行脫色、酶解、萃取、脫鹽、低溫真空離心等處理后，與 HCCA基質混勻，取2μL點于樣品靶上室溫干燥，插入質譜儀的樣品室中打譜。

1．6 質譜分析

質譜樣品使用美國基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜系統(tǒng)MALDI-TOF-MS進行分析，采用反射模式，離子源加速電壓1為20000V，加速電壓2為23000V，N2激光波長337nm，脈沖寬度3ns，離子延遲2000nsec，真空度4×10－7pa，質譜信號單次掃描累加50次，用標準Marker峰作為外標校正質譜峰，正離子譜測定獲得肽質量指紋圖譜。

1．7 數(shù)據(jù)庫的查詢

通過 Matrixscience公司網(wǎng)站提供的Mascotwizard軟件進行，具體按照 http∥www．matrix science．com/cgi/search．fromselecthtml進 行 查 詢。查詢條件:分子量、等電點未作限定，肽片斷分子量的誤差范圍100ppm，未水解的酶位點數(shù)為1，蛋白種屬選擇大鼠，Mass values選擇為 MH+，選擇Monoisotopic，固定修飾選擇為Carbamidomethyl(C)，可變修飾不選。

2 結果

2．1 卵巢切除術后骨質疏松模型造模成功的檢查

通過骨密度、生物力學、病理學檢測顯示，模型組和假手術組相比較，腰椎骨密度明顯下降，骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴大，骨梁髓比明顯下降，右脛所能承受的最大壓力下降，說明大鼠去卵巢后不僅有骨量的減少，還有骨強度的下降，這些特征與絕經(jīng)后骨質疏松的生理改變類似，說明本實驗中的病理模型復制成功。

2．2 大鼠骨組織蛋白雙向電泳圖譜的比較

圖1 大鼠股骨組織蛋白雙向電泳各組圖譜的比較

圖1顯示，3張圖譜非常相似，蛋白點主要集在pI5-7和Mw 10～100KD區(qū)域。從整個圖譜分析，肉眼可辨別大約320多個蛋白點，且蛋白點之間區(qū)分比較清晰，可以對其進行蛋白質表達的差異分析。對模型組、全方組、假手術組股骨組織蛋白雙向電泳圖譜比較，共發(fā)現(xiàn)32個明顯差異蛋白，其中重點選擇了3個差異蛋白進行分析，分別命名為Px1、Px2、Px3，其分子量依次約為43kD、79kD、44kD。表1顯示，采用雙向電泳圖譜分析軟件(Ge-nomic So1utions Investigator HT Analyzer version 2．02)對差異蛋白的相對含量進行分析。

表1 大鼠股骨組織蛋白雙向電泳圖譜差異蛋白在各組的相對含量比較

2．3 MALDI-TOF-MS肽質量指紋圖譜分析

對3個差異蛋白進行MALDI-TOF-MS分析，得到各自的肽質量指紋圖譜。圖2顯示，3個肽質量指紋圖譜信號較強，基線平穩(wěn)，適合進一步數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。根據(jù)得到的肽質量指紋圖譜數(shù)據(jù)，通過Marx scienee網(wǎng)站提供的Mascot wizard軟件查詢與之相匹配的蛋白，搜索結果見表2(僅列示PX1的指紋圖譜)。

圖2 大鼠股骨組織蛋白2-DE圖譜中蛋白PX1的肽質量指紋圖譜

由搜索結果可看出，Px1為血清轉鐵蛋白，Px2為肌酸激酶A，Px3為果糖二磷酸醛縮酶A。

表2 Px1、Px2、Px3在數(shù)據(jù)庫搜索的結果

3 討論

通過比較不同組間股骨蛋白質分子以及圖譜，找到了相對應的差異蛋白質，根據(jù)它們質和量的不同，分別命名為 Px1、Px2、Px3。

Px1與之相對的蛋白是Creatine kinase M-type，即肌酸激酶A型。肌酸激酶是一種轉移酶類，它廣泛分布于各組織中，分別為 MM(肌肉型)、BB(腦型)、MB(雜化型)，其中M型主要分布在骨骼肌中。研究表明，哺乳動物肌細胞收縮的能量來源于ATP，肌細胞內 ATP的數(shù)量足以滿足肌肉收縮30～100次的需要，而肌酸激酶則為快速恢復ATP含量所必需的高能磷酸化合物，靜息狀態(tài)下肌肉組織中的磷酸肌酸的濃度為ATP的3～8倍。肌細胞收縮消耗ATP后，磷酸肌酸隨即予以補充，即磷酸肌酸在肌酸激酶的作用下，迅速將高能磷酸鍵轉移到ADP上生成ATP，以供肌細胞的活力;骨質疏松時，骨骼肌收縮力下降，肌肉活力減退，因此肌酸激酶在骨質疏松中有很重要的作用，在實驗中，全方組肌酸激酶的活力最強，假手術組居中，模型組最低，說明壯骨止痛方有可能是通過提高肌酸激酶的活力來達到治療骨質疏松癥的。

Px2與之相對的蛋白是 Serotransferrin，即血清鐵傳遞蛋白，轉鐵蛋白是一個能夠和鐵相結合的蛋白家族［2］。轉鐵蛋白具有多態(tài)性，主要被劃分為血清轉鐵蛋白、卵(清)轉鐵蛋白、乳(清)轉鐵蛋白3類。血清轉鐵蛋白來源于血清，還存在于其他體液如膽汁、羊水、腦脊液、淋巴液和乳汁中，通過這些生物體液結合并轉運鐵離子，其主要作用是在鐵的吸收、貯存、利用中扮演著運輸?shù)慕巧?，它調控著鐵的代謝，阻止游離鐵通過自由基的形成對細胞的毒副作用，運輸細胞外的鐵［3］，每分子轉鐵蛋白能結合二元子鐵，因為細胞內的許多酶，例如核糖核苷酸還原酶，需要以鐵作為輔基，因此轉鐵蛋白對細胞的存活和生長十分重要。另外，轉鐵蛋白還能結合、輸送其他金屬離子、治療性金屬離子、診斷用的放射性金屬離子等。近年來，許多研究結果認為體內鐵代謝平衡和紊亂與骨質礦化有著密切的聯(lián)系。在研究絕經(jīng)女性骨質疏松治療、預防時發(fā)現(xiàn)，鐵的攝入與骨的礦化密度呈正相關［4、5］。在本實驗中，模型組該蛋白相對表達，在假手術組相對較高，全方組表達最高，說明切除卵巢也許破壞了轉鐵蛋白的運輸通道，經(jīng)過壯骨止痛方的治療，在某些方面恢復了鐵的重新正常轉運，從而達到治療骨質疏松癥的作用。

Px3與之相對的蛋白是Fructose-bisphosphate aldolase A，即果糖二磷酸醛縮酶 A，醛縮酶是糖酵解過程中的一個重要酶類，能催化果糖-1，6-二磷酸(FDP)和果糖-1-磷酸(FIP)為底物的裂解，將其分解為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮。目前研究表明，哺乳動物組織中存在3種ALD同工酶，為A型(肌型)、B型(肝型)、C型(腦型)，其中 A型主要存在于肌肉組織中［6］。在臨床中，經(jīng)常以FDP/FIP的比值為單位來測量人體組織，特別是肌肉組織中的醛縮酶活力［7］。在人體活動時，均需要消耗能量ATP，在ATP的合成過程中，醛縮酶A在糖原或葡萄糖生成ATP，同時反映生成丙酮酸或乳酸的過程中，并發(fā)揮重要的作用［8］，尤其是 1，6-二磷酸果糖轉化為3-磷酸甘油醛中尤顯重要，在整個反應過程里，ATP產生的越多肌肉細胞則能自由運動，如果肌酸產生過度，肌肉則活動無力甚至易疲勞，故有人把肌酸稱為“疲勞素”。在本實驗中，假手術組醛縮酶A表達值最高，全方組次之，模型組最低，說明大鼠去卵巢后，醛縮酶A的作用下降，全方組在調整醛縮酶A的活力方面起到了重要作用，也驗證了該方對絕經(jīng)后骨質疏松癥有良好療效。

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R285．5

B

1006-3250(2012)02-0166-03

2009年國家自然科學基金面上項目(30873291)

楊 軍(1971-)男，甘肅蘭州人，主治醫(yī)師，講師，在讀博士，從事中醫(yī)老年病研究。

2011-07-15