哈蟆油中免疫活性部位的提取工藝與藥效學(xué)研究Δ

王微，鄭飛，李霞，張煒煜（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117）

哈蟆油為中國林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）雌蛙的干燥輸卵管，又稱“林蛙油”。該藥是2010年版《中國藥典》收載品種，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤肺之功效；用于治療陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗不止、癆嗽咳血[1]。有研究表明，蛋白質(zhì)被水解成小分子的肽類或游離氨基酸后，更易被人體快速和多途徑吸收[2～4]。蛋白質(zhì)可用酶法或酸法水解分離出，但酶法水解蛋白質(zhì)較酸法水解作用溫和且條件容易控制。因此筆者對(duì)哈蟆油中有效部位，即蛋白質(zhì)采用酶法進(jìn)行提取，并通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其免疫調(diào)節(jié)作用，為哈蟆油的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JA5103N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；pHS-25C型數(shù)字酸度劑（上海鵬順科學(xué)儀器有限公司）；HHS21-Hi6電熱恒溫水浴鍋（北京市長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；E53042432型移液器（日本Nichirtyo公司）；WFH-203J型三用紫外-可見分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

哈蟆油為中國林蛙（中國林蛙購自吉林省樺甸市蘇密溝林場，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為真品）雌蛙蛙體干燥后剝?nèi)〉妮斅压埽婵?0℃烘干后，粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，－5℃冰柜貯藏；環(huán)磷酰胺（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20100103）；木瓜蛋白酶（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：98010420）；氫氧化鈉、硫酸銅、鹽酸、硫酸鉀、硫酸、甲醛均為分析純。

1.3 動(dòng)物

ICR小鼠140只，♀♂兼半，體重（20±2）g，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：0003217）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酶解液水解度和收率的測定

精密吸取酶解液5.0mL，置于錐形瓶中，加入20.0mL去二氧化碳蒸餾水，攪拌均勻，加入0.01mol·L－1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH值至8.2，加入已中和好的甲醛溶液10mL，記錄將其pH值調(diào)節(jié)至9.2時(shí)所耗0.01mol·L－1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；以相同方法進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，記錄毫升數(shù)。則水解液氨基氮為：水解液氨基氮（g·100g－1）＝（A－B）×N×V1×K×100/V（A：滴定水解液樣品消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；B：滴定空白樣品消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；N：滴定NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol·L－1）；K：1mL 1mol·L－1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量（g），K＝0.014；V：滴定水解液樣品的體積（mL），在該試驗(yàn)中V＝5mL；V1：水解液的總體積（mL））。

水解度（%）＝水解液氨基氮/樣品總氮量×100%

收率（%）＝提取物干重/生藥材×100%

2.2 酶法水解哈蟆油中蛋白質(zhì)的提取工藝優(yōu)選

2.2.1 哈蟆油中蛋白質(zhì)1次水解提取工藝優(yōu)選 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，確定考察因素為提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、木瓜蛋白酶量（C）和提取pH值（D）。采用L9（3）4正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，以酶解液的水解度和收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過綜合評(píng)分（綜合評(píng)分＝0.4×收率+0.6×水解度）確定最佳工藝。因素水平見表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of analysis of variance

由表2、表3可知，通過綜合評(píng)分，影響哈蟆油1次水解工藝因素的主次順序?yàn)樘崛囟龋久噶浚咎崛r(shí)間＞提取pH值，提取溫度對(duì)水解工藝有顯著性影響（P＜0.05）。結(jié)合上述結(jié)果，從降低成本、提高效率考慮，哈蟆油（P＜0.05）1次水解的最佳工藝條件為A1B2C1D1，即加木瓜蛋白酶2000u·g－1，調(diào)節(jié)pH值至6.0，在45℃下提取4.5h。

2.2.2 哈蟆油中蛋白質(zhì)2次水解提取工藝優(yōu)選 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，確定考察因素為提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、固液比（C，V/V）和提取pH值（D）。采用L9（3）4正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，以酶解液的水解度和收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過綜合評(píng)分（計(jì)算同“2.2.1”項(xiàng)下方法）確定最佳工藝。因素水平見表4；正交試驗(yàn)結(jié)果見表5；方差分析結(jié)果見表6。

表4 因素水平Tab 4 Factors and levels

由表5、表6可知，通過綜合評(píng)分，影響哈蟆油2次水解工藝的因素的主次順序?yàn)楣桃罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度＞提取pH值，固液比對(duì)水解工藝有顯著性影響（P＜0.05）。結(jié)合單因素試驗(yàn)和上述結(jié)果，從降低成本、提高效率考慮，哈蟆油2次水解的最佳工藝條件為A1B1C2D1，即固液比為1∶20（V/V），調(diào)pH值至6.0，在40℃下提取4.5h。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析結(jié)果Tab 6Results of analysis of variance

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按1次水解最佳工藝條件提取3批哈蟆油中蛋白質(zhì)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，3批樣品哈蟆油酶解液的平均收率為31.4%，RSD＝2.6%，平均水解度為30.85%，RSD＝1.8%；進(jìn)一步按2次水解最佳工藝條件提取3批哈蟆油中蛋白質(zhì)。結(jié)果，3批樣品中哈蟆油酶解液收率為25.0%，RSD＝2.0%，平均水解度為34.58%，RSD＝1.9%；采用酶法水解提取哈蟆油中蛋白質(zhì)，2次酶解所得哈蟆油酶解液收率為56.4%，水解度為65.43%。與正交試驗(yàn)結(jié)果最高值相當(dāng)，表明該工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 哈蟆油提取物雙向免疫調(diào)節(jié)作用的研究

2.4.1 復(fù)制模型[5，6]ip環(huán)磷酰胺30mg·kg－1，每天1次，連續(xù)5d，復(fù)制免疫低下小鼠模型；ip環(huán)磷酰胺 200mg·kg－1，每天1次，連續(xù)3d，復(fù)制免疫增強(qiáng)小鼠模型。

2.4.2 哈蟆油提取物對(duì)免疫低下模型小鼠免疫功能的影響

實(shí)驗(yàn)分為8組，即空白、模型、常溫酶解（0.1g·kg－1）和蛤蟆油提取物①、②、③、④、⑤（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80g·kg－1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)7d。分別以小鼠免疫器官的臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬系數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，驗(yàn)證哈蟆油提取物對(duì)免疫低下小鼠功能的影響。哈蟆油提取物對(duì)免疫低下模型小鼠免疫功能的影響見表7。

由表7可知，與空白組比較，模型組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，蛤蟆油提取物②、③、④、⑤組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與空白組比較，模型組吞噬指數(shù)顯著性降低（P＜0.05）；與模型組比較，哈蟆油提取物②組吞噬指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，哈蟆油0.1g·kg－1對(duì)免疫低下小鼠的免疫功能有明顯的增強(qiáng)作用，并且對(duì)受損傷的免疫器官起到保護(hù)作用。

表7 哈蟆油提取物對(duì)免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響（±s，n＝10）Tab 7 Effects of R.temporaria chensinensis extract on visceral index of low immunity model mic（e±s，n＝10）

表7 哈蟆油提取物對(duì)免疫力低下模型小鼠免疫功能的影響（±s，n＝10）Tab 7 Effects of R.temporaria chensinensis extract on visceral index of low immunity model mic（e±s，n＝10）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

給藥劑量/g·k g－1組別空白組模型組哈蟆油提取物①組哈蟆油提取物②組哈蟆油提取物③組哈蟆油提取物④組哈蟆油提取物⑤組常溫酶解組- -吞噬指數(shù)0.028±0.0050.024±0.003＊0.016±0.0060.035±0.010##0.020±0.0060.018±0.0030.020±0.0030.016±0.0060.050.100.200.400.800.10臟器指數(shù)脾指數(shù)/g·k g－1 4.67±0.762.04±0.43＊＊2.50±0.732.75±0.80#2.83±0.90#2.72±0.66#2.64±0.61#2.81±0.84#胸腺指數(shù)/g·k g－1 3.81±0.500.80± 0.17＊＊1.00±0.251.25±0.38##1.26±0.45##1.48±0.50##1.34±0.62##1.16±0.75

2.4.3 哈蟆油提取物對(duì)免疫增強(qiáng)小鼠免疫功能的影響 實(shí)驗(yàn)分為6組，即空白、模型、常溫酶解（0.1g·kg－1）和蛤蟆油提取物高、中、低劑量（0.4、0.2、0.1g·kg－1）組。ig給藥，每天1次，連續(xù)7d。分別以小鼠免疫器官的臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，驗(yàn)證哈蟆油提取物對(duì)免疫增強(qiáng)模型小鼠免疫功能的影響。哈蟆油提取物對(duì)免疫增強(qiáng)模型小鼠免疫功能的影響見表8。

表8 哈蟆油提取物對(duì)免疫力增強(qiáng)模型小鼠免疫功能的影響（±s，n＝10）Tab 8Effect of R.temporaria chensinensis extract on phagocytic function of macrophage in high immunity model mice（±s，n＝10）

表8 哈蟆油提取物對(duì)免疫力增強(qiáng)模型小鼠免疫功能的影響（±s，n＝10）Tab 8Effect of R.temporaria chensinensis extract on phagocytic function of macrophage in high immunity model mice（±s，n＝10）

與空白組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

吞噬指數(shù)3.81±0.501.03±0.22＊＊1.33±0.44#1.46±0.47##1.42±0.42##1.26±0.30#給藥劑量/g·k g－1組別空白組模型組哈蟆油提取物低劑量組哈蟆油提取物中劑量組哈蟆油提取物高劑量組常溫酶解組- -0.100.200.400.10臟器指數(shù)脾指數(shù)/g·k g－1 4.67±0.761.17±0.18＊1.63±0.39#1.73±0.41#1.75±0.36#1.45±0.12#胸腺指數(shù)/g·k g－1 0.028±0.0050.034±0.010＊0.025±0.005#0.018±0.004##0.014±0.004##0.026±0.009

由表8可知，與空白組比較，模型組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，哈蟆油提取物高、中、低劑量組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。與空白組比較，模型組吞噬指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，哈蟆油提取物高、中、低劑量組吞噬指數(shù)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。研究顯示，哈蟆油0.1、0.2、0.4g·kg－1對(duì)免疫增強(qiáng)模型小鼠有顯著的抑制作用，以用藥少、療效好為原則，綜合“2.3.2”結(jié)果，最后設(shè)定0.2g·kg－1為有效劑量。

3 討論

現(xiàn)代研究表明，哈蟆油含水、無機(jī)物、粗脂肪、蛋白質(zhì)、多種激素等多種成分。胡鑫等[7]測定的哈蟆油粗蛋白含量達(dá)50%以上，故采用正交試驗(yàn)法對(duì)哈蟆油中蛋白質(zhì)進(jìn)行最佳提取工藝的研究，由于1次水解不夠完全，所以采用2次水解。

單因素考察結(jié)果表明，固液比對(duì)哈蟆油水解度和收率的影響較大；隨著固液比的增大，酶解液的水解度和收率逐漸增大。當(dāng)固液比為1∶20（V/V），水解度和收率均達(dá)到最大值，分別為19.96%、24.93%。由于酶解液中含水量過多使干燥困難，故將哈蟆油水解的固液比水平確定在1∶18～1∶22范圍內(nèi)。

0.1g·kg－1哈蟆油提取物對(duì)免疫低下模型小鼠免疫功能有顯著的增強(qiáng)作用。與模型組比較，哈蟆油提取物低劑量組能夠升高吞噬系數(shù)，用以達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用，臟器指數(shù)顯著提高，對(duì)環(huán)磷酰胺造成的臟器萎縮起到保護(hù)的作用。

0.2g·kg－1哈蟆油提取物對(duì)免疫增強(qiáng)模型小鼠有顯著的抑制作用。與模型組比較，哈蟆油提取物中劑量組吞噬系數(shù)顯著升高，用以達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用，臟器指數(shù)明顯改善，對(duì)環(huán)磷酰胺造成的臟器萎縮起到保護(hù)的作用。

綜上，所選提取方法合理、可行，提取的蛋白質(zhì)有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

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