因寧片的急性和慢性毒性實驗研究Δ

周濤，李國熊，茹麗，侯連兵（1.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣州510515；.重慶市中山醫院，重慶 40001；.廣州中醫藥大學科技產業園，廣州 510445）

因寧片為南方醫院院內制劑，是由昆明山海棠、黃芪、當歸等9味中藥組成的復方制劑，適應證為甲狀腺功能亢進（甲亢）。臨床前研究與臨床應用均表明因寧片對甲亢具有良好的改善作用[1，2]。其中昆明山海棠具有抗炎、免疫抑制的作用[3]，黃芪具有增強免疫功能、增強機體耐缺氧與抗應激能力等作用[4]。為了進一步評價因寧片的安全性，筆者進行了急性和慢性毒性實驗，為臨床安全用藥提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PocH-100iV Diff型全自動動物血液分析儀（日本Sysmex公司）；7080型全自動生化分析儀（日本日立公司）；DMRA自動旋轉熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 試藥

因寧片（南方醫院藥學部制劑中心，批號：20110618，0.3g/片，1g相當于3.38g中藥材）；蒸餾水（新南方藥物安全性評價中心）。

1.3 動物

SPF級KM小鼠40只，♀♂兼半，體重18～22g；SPF級SD大鼠48只，♀♂兼半，體重140～160g，均由廣東省醫學實驗動物中心提供（動物使用許可證號：SYXK（粵）2008-0014）。

2 方法

2.1 因寧片對小鼠的急性毒性實驗

通過預實驗，未測出半數致死量（LD50），轉而測定最大耐受量（MTD）。將40只小鼠，按預編號與體重分層數字隨機分為2組，即空白對照（等容生理鹽水）、因寧片（32g·kg－1）組，24h內2次ig給藥（間隔6h）。給藥間隔期間連續觀察小鼠的反應，給藥結束后每天上、下午各觀察1次，連續14d，每天記錄小鼠的一般狀況，包括外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況與中毒反應（中毒反應的癥狀、嚴重程度、起始時間、持續時間、是否可逆）等，并記錄體重和攝食量，實驗結束后大體解剖小鼠，肉眼觀察各臟器的病變情況。

2.2 因寧片對大鼠的慢性毒性實驗

將48只大鼠隨機分為4組，即空白對照（等容生理鹽水）與因寧片高、中、低劑量（6、3、0.6g·kg－1，相當于臨床人日劑量的100、10、5倍）組。ig給藥，每天1次，連續30d，給藥期間大鼠自由攝食和飲水。每天觀察記錄大鼠的一般狀況如進食、行為活動、糞便等。每周稱體重，記錄攝食量，并根據體重變化及時調整用藥劑量。末次給藥24h后，ip3%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動脈采血，采集的血樣于血液分析儀上檢測紅細胞（RBC）、中性粒細胞（NE）、嗜酸性粒細胞（EO）、嗜堿性粒細胞（BA）、網織RBC、單核巨噬細胞（MO）、血紅蛋白（HGB）、RBC壓積（HCT）、平均RBC體積（MCV）、平均RBC血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板（PLT）、淋巴細胞（LY）等血液學指標。另取血分離血清，于自動生化分析儀上測定血液生化指標（谷丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、尿素氮（URE）、總膽紅素（BIL）、血清鈣（Ca）、堿性磷酸酶（ALP）、膽固醇（CHO）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、甘油三酯（TG）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清鈉（Na）、血清鉀（K）、血清氯（Cl））。對主要臟器進行全面尸檢，取腦、心、肝、脾、肺、腎等臟器稱重，計算臟器系數（臟器/體重）。主要臟器用10%甲醛固定，進行常規病理學檢查。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 對小鼠的急性毒性實驗

3.1.1 因寧片對小鼠一般狀況的影響和MTD的測定 給藥間隔期間和14d觀察期內，各組小鼠精神和自主行為活動狀況良好、皮膚被毛清潔、大小便正常，亦未見其它毒性反應癥狀。根據因寧片混懸液的最大濃度（0.4g·mL－1）和小鼠的最大ig體積（40mL·kg－1），得出MTD為32g·kg－1，相當于臨床人日劑量（0.06g·kg－1）的534倍。

3.1.2 因寧片對小鼠體重變化的影響 小鼠體重增長正常，各個時期因寧片組與空白對照組比較，體重無顯著性差異（P＞0.165），提示因寧片對小鼠的體重變化無影響。因寧片對小鼠體重變化的影響見表1。

表1 因寧片對小鼠體重變化的影響（±s）Tab 1 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in mice（±s）

表1 因寧片對小鼠體重變化的影響（±s）Tab 1 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in mice（±s）

劑量/g·kg－1n 體重/g 組別空白對照組因寧片組-322020給藥前19.55±1.8219.13±1.30第1d 22.21±1.7022.80±1.30第2d 26.91±3.3127.97±2.64第7d 29.68±3.3130.88±4.51第14d 32.97±5.4934.65±6.80

3.1.3 因寧片對小鼠攝食量的影響 因寧片組與空白對照組比較，小鼠的攝食量無顯著性差異（P＞0.337），提示因寧片對小鼠的攝食量無影響。因寧片對小鼠攝食量的影響見表2。

表2 因寧片對小鼠攝食量的影響（±s）Tab 2Effects of Yinning tablets on food intake in mice（±s）

表2 因寧片對小鼠攝食量的影響（±s）Tab 2Effects of Yinning tablets on food intake in mice（±s）

劑量/g·kg－1n 攝食量（g·10g－1）組別空白對照組因寧片組-322020第3d 2.48±0.252.33±0.15第6d 2.06±0.202.01±0.16第13d 1.83±0.151.83±0.03

3.1.4 因寧片對小鼠各臟器的影響 給藥結束后第14d大體解剖小鼠，肉眼觀察各臟器，心、肝、脾、肺、腎等均無異常。

3.2 對大鼠的慢性毒性實驗

3.2.1 因寧片對大鼠一般狀況的影響 給藥期間，因寧片高、中、低劑量組大鼠的外觀體征、行為活動、進食量與糞便等狀況均正常，大鼠無一死亡。

3.2.2 因寧片對大鼠體重變化的影響 大鼠體重增長正常，與空白對照組比較，各個時期因寧片高、中、低劑量組體重無顯著性差異（P＞0.783），提示因寧片對大鼠的體重變化無影響。因寧片對大鼠體重變化的影響見表3。

表3 因寧片對大鼠體重變化的影響（±s）Tab 3 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in rats（±s）

表3 因寧片對大鼠體重變化的影響（±s）Tab 3 Effects of Yinning tablets on the variation of body weight in rats（±s）

組別空白對照組因寧片低劑量組因寧片中劑量組因寧片高劑量組劑量/g·kg－1n體重/g-0.63 612121212給藥前226.69±28.22223.33±27.65223.12±28.80225.23±26.11第7d 271.81±48.93266.63±46.55268.24±47.66275.41±44.14第14d 311.25±65.20300.47±61.40313.73±61.67298.29±55.65第21d 343.84±74.95324.78±72.80345.43±74.50323.14±66.44第28d 369.50±91.30352.99±85.33374.91±86.39342.48±76.54

3.2.3 因寧片對大鼠攝食量變化的影響 大鼠攝食量正常，與空白對照組比較，各個時期因寧片高、中、低劑量組攝食量無顯著性差異（P＞0.221），提示因寧片對大鼠的攝食量無影響。因寧片對大鼠攝食量的影響見表4。

3.2.4 因寧片對大鼠血液學指標的影響 與空白對照組比較，因寧片低劑量組RBC、HGB、HCT、LY數顯著升高（P＜0.01），PLT、NE、EO數顯著降低（P＜0.01）；因寧片中劑量組NE、網織RBC數、EO數顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），LY、MO數顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；因寧片高劑量組大鼠的LY數顯著升高（P＜0.05），EO數顯著降低（P＜0.01）。因寧片對大鼠血液學指標的影響見表5。

表4 因寧片對大鼠攝食量的影響（±s）Tab 4 Effects of Yinning tablets on food intake in rats（±s）

劑量/g·kg－1n 攝食量（g·10g－1）組別空白對照組因寧片低劑量組因寧片中劑量組因寧片高劑量組-0.63 612121212第7d 9.51±0.649.00±0.299.43±0.408.98±0.30第14d 8.08±0.668.03±0.138.15±0.518.10±0.32第21d 8.40±0.657.73±0.538.18±0.318.38±0.82第28d 7.78±0.687.53±0.507.33±0.337.75±0.17

表5 因寧片對大鼠血液學指標的影響（±s）Tab 5 Effects of Yinning tablets on hematology index in rats（±s）

表5 因寧片對大鼠血液學指標的影響（±s）Tab 5 Effects of Yinning tablets on hematology index in rats（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

檢測項目WBC/×103·μL－1 RBC/×106·μL－1 HGB/g·dL－1 HCT/%MCV/fL MCH/pg MCHC/g·dL－1 PLT/×103·μL－1 NE/%LY/%EO/%MO/%BA/%網織紅細胞/%因寧片高劑量組4.98±1.127.90±0.6615.67±1.0745.03±3.2457.08±2.0719.85±0.9234.81±0.541334.42±136.1214.58±3.4582.58±3.80＊1.16±1.03＊＊1.67±0.490.00±0.000.81±0.14空白對照組4.84±1.058.20±0.5916.07±1.1745.96±3.3456.08±1.2019.60±0.4734.97±0.271393.58±123.5016.42±2.7179.75±3.252.33±0.891.50±0.520.00±0.000.83±0.15因寧片低劑量組4.78±1.419.67±1.41＊＊19.03±2.60＊＊54.63±7.43＊＊56.62±1.8119.73±0.8934.85±0.611173.75±230.18＊＊12.58±3.26＊＊84.83±3.51＊＊1.17±0.72＊＊1.42±0.790.00±0.000.76±0.09因寧片中劑量組5.88±1.568.34±0.4416.20±0.7146.68±2.5655.98±1.4119.41±0.6134.70±0.291434.55±152.0913.18±1.47＊83.45±1.81＊＊1.18±0.60＊＊2.09±0.83＊0.00±0.000.70±0.08＊

3.2.5 因寧片對大鼠血液生化指標的影響 與空白對照組比較，因寧片低劑量組TG含量顯著降低（P＜0.05）；因寧片中劑量組GLU含量顯著降低（P＜0.01），Na顯著升高（P＜0.05）；因寧片高劑量組TP、ALb、TG含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。因寧片對大鼠血液生化指標的影響見表6。

表6 因寧片對大鼠血液生化指標的影響（±s）Tab 6Effects of Yinning tablets on blood biochemical index in rats（±s）

表6 因寧片對大鼠血液生化指標的影響（±s）Tab 6Effects of Yinning tablets on blood biochemical index in rats（±s）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

檢測項目ALT/U·L－1 Cre/μmol·L－1 GLU/mmol·L－1 URE/mmol·L－1 BIL/μmol·L－1 Ca/mmol·L－1 ALP/U·L－1 CHO/mmol·L－1 TP/g·L－1 ALb/g·L－1 CK/U·L－1 LDH/U·L－1 TG/mmol·L－1 AST/U·L－1 Na/mmol·L－1 K/mmol·L－1 Cl/mmol·L－1因寧片高劑量組26.82±5.3727.11±4.136.25±0.516.68±0.880.68±0.322.30±0.06127.69±42.271.42±0.3252.45±2.14＊34.43±1.74＊＊399.18±89.80683.38±182.370.36±0.12＊＊101.14±15.12143.50±0.843.98±0.31106.03±1.74空白對照組24.71±5.5828.88±4.746.56±0.637.23±1.020.74±0.272.35±0.06135.81±41.811.39±0.2754.96±2.8436.43±2.03422.55±98.58898.17±301.380.64±0.31111.69±25.78143.16±1.324.18±0.25105.90±2.34因寧片低劑量組21.20±4.5430.78±4.976.62±0.567.95±1.180.68±0.292.41±0.11129.43±34.481.31±0.2354.64±2.6536.25±1.86421.73±108.16791.88±206.800.45±0.15＊95.48±11.87144.05±0.984.15±0.24107.02±1.26因寧片中劑量組25.94±6.7030.09±6.605.61±0.50＊＊7.26±1.330.82±0.192.32±0.05123.50±29.321.33±0.2553.76±1.7135.68±1.41469.58±129.181060.44±368.740.49±0.24122.03±28.60144.36±1.38＊4.10±0.27105.78±2.07

3.2.6 因寧片對大鼠各臟器的影響 因寧片高、中、低劑量組大鼠的各臟器系數與空白對照組比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。因寧片對大鼠各臟器系數的影響見表7。

3.2.7 因寧片對大鼠組織器官的影響 末次給藥24h后，處死各組大鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胃等臟器外形、體積、色澤均屬正常，無充血、腫脹、壞死等異常現象。各臟器用10%甲醛固定48h后，按常規法做病理切片，光鏡下觀察。結果，因寧片高、中、低劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器與空白對照組比較，均未見異常。病理組織學檢查未見到由于因寧片毒性引起的病理改變。臟器病理切片見圖1。

表7 因寧片對大鼠各臟器系數的影響（±s）Tab 7 Effects of Yinning tablets on organ coefficient in rats（±s）

表7 因寧片對大鼠各臟器系數的影響（±s）Tab 7 Effects of Yinning tablets on organ coefficient in rats（±s）

n臟器腦胸腺心臟肝臟脾臟肺臟腎臟腎上腺睪丸附睪卵巢子宮12121212121212126 6 6 6空白對照組0.64±0.140.15±0.040.32±0.032.89±0.150.21±0.030.43±0.061.23±0.660.02±0.010.85±0.060.26±0.030.06±0.010.23±0.03因寧片低劑量組0.66±0.150.15±0.050.32±0.032.79±0.180.20±0.020.47±0.081.09±0.490.02±0.010.80±0.160.24±0.020.05±0.010.17±0.08因寧片中劑量組0.63±0.130.15±0.040.31±0.022.90±0.170.21±0.020.44±0.091.17±0.470.02±0.010.86±0.070.27±0.030.06±0.010.25±0.05因寧片高劑量組0.67±0.130.14±0.030.31±0.022.89±0.180.21±0.020.45±0.061.21±0.510.02±0.010.93±0.080.27±0.020.06±0.010.22±0.06

圖1 臟器病理切片A1.空白對照組心臟；A2.因寧片高劑量組心臟；B1.空白對照組肝臟；B2.因寧片高劑量組肝臟；C1.空白對照組脾臟；C2.因寧片高劑量組脾臟；D1.空白對照組肺；D2.因寧片高劑量組肺；E1.空白對照組腎臟；E2.因寧片高劑量組腎臟；F1.空白對照組胃；F2.因寧片高劑量組胃Fig 1 Pathological section of several organsA1.blank control group heart；A2.Yinning tablet high dose group heart；B1.blank control group liver；B2.Yinning tablet high dose group liver；C1.blank control group spleen；C2.Yinning tablet high dose group spleen；D1.blank control group lung；D2.Yinning tablet high dose group lung；E1.blank control group kidney；E2.Yinning tablet high dose group kidney；F1.blank control group stomach；F2.Yinning tablet high dose group stomach

4 討論

甲亢是由多種原因引起甲狀腺激素過多導致機體代謝過高的內分泌疾病。甲亢可以影響多個器官系統，包括心血管系統、神經系統、胃腸道與肝臟等[5]。前期實驗證明，因寧片可以降低甲亢大鼠的三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）水平，升高促甲狀腺激素（TSH）水平，具有抗甲亢的作用[1，2]。

甲亢性肝損害臨床常見，其發生率國內、外報道不一，國內學者研究得出111例新診Graves患者中有52.6%存在肝功能異常[6]。甲亢性肝損害的發生機制主要有肝臟的氧化應激反應、肝細胞的凋亡等。本研究結果表明，因寧片各劑量組與空白對照組比較，肝功能指標（ALT、AST、BIL、ALP、TP）均無顯著性差異，說明因寧片對肝臟無毒性作用。與此同時，本課題組前期研究發現：因寧片對甲亢性肝損害具有保護作用，可能機制如下：降低肝臟丙二醛（MDA）含量，增強超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，提高抗氧化系統清除自由基的能力，糾正氧化和抗氧化系統失衡[2]；降低甲亢性肝損害大鼠肝臟脂肪酸合成酶（Fas）、Fas配體（FasL）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達[7]；使甲亢大鼠肝細胞天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3蛋白表達明顯下調，B細胞淋巴瘤/白血病（Bcl）-2蛋白表達明顯上調[8]。

本研究結果表明，急性毒性實驗未測出因寧片的LD50，在MTD的情況下也未出現毒性反應；慢性毒性實驗在高劑量的情況下，大鼠一般狀況正常，未出現明顯毒性反應和死亡，可見因寧片比較安全。因寧片對實驗大、小鼠的體重和攝食量都沒有影響。因寧片各組RBC、HGB、HCT、LY、EO、PLT、NE、網織RBC、GLU、TP、ALb、TG較空白對照組有輕微變化，但均在允許范圍之內[9]，產生原因尚不明確，可能的原因是昆明山海棠具有抗炎、免疫抑制等藥效學與毒理學性質有關[10]，但在本組方中用量較小，無顯著性影響。

綜上，本文急性毒性和慢性毒性實驗證明，因寧片毒性低，可為臨床安全用藥提供理論依據。

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