結(jié)核分枝桿菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表達(dá)、純化與鑒定

孫毅凡 李海成 周杰 錢明 陳濤 江勇 賴賽麟 江振友 鐘球 周琳

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的。據(jù)報(bào)道，2010年全球結(jié)核病新增患者約有880萬(wàn)［1］。我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，占全球發(fā)病的14%，位居全球第2位［2］。我國(guó)結(jié)核病疫情仍很嚴(yán)重，因此圍繞研發(fā)保護(hù)性疫苗、改進(jìn)診斷技術(shù)一直是結(jié)核病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌能分泌大量的免疫原性蛋白，其中由Rv3803c基因編碼的MPT51蛋白，與Ag85復(fù)合體有很大程度的同源性［3］，其可能作為有效的保護(hù)性抗原在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。SodA由結(jié)核分枝桿菌Rv3846基因編碼，是一種由致病性分枝桿菌大量分泌的毒力因子，可將宿主巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基轉(zhuǎn)換為過(guò)氧化氫［4］，從而對(duì)抗巨噬細(xì)胞的氧化攻擊。筆者克隆表達(dá)了Rv3803c、Rv3846基因，對(duì)其編碼的蛋白 MPT51、SodA進(jìn)行純化鑒定，為進(jìn)一步探討相關(guān)分泌抗原的輔助診斷價(jià)值，構(gòu)建保護(hù)性疫苗及篩選藥物靶點(diǎn)等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

一、菌種和載體

Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為本中心保存，大腸埃希菌（E．coli）TOP10菌株、E．coli Rosetta菌株購(gòu)自中國(guó)Transgen公司，pGEX－6P－1載體（氨芐青霉素抗性，多克隆位點(diǎn)BamHⅠ，EcoRⅠ，SmaⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，NotⅠ）購(gòu)自美國(guó)GE公司。

二、酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Pyrobest DNA聚合酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（anti－GST）鼠單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruse公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)promega公 司，異 丙 基－β－D－硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、氨芐青霉素、還原性谷胱甘肽購(gòu)自鼎國(guó)生物公司，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)GE公司，電化學(xué)發(fā)光液（electrochemiluminescence，ECL）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

三、Rv3803c、Rv3846基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法

（一）基因克隆和鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板分別擴(kuò)增Rv3803c、Rv3846。

Rv3803c上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC－3′； 下游引物：5′－GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG－3′。

Rv3846上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC－3′； 下游 引 物：5′－GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC－3′。

Rv3803c的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃3min，94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 70s，30個(gè)循環(huán)；Rv3846的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃3min，94℃30s，62℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶酶切之后，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，T4連接酶連接到表達(dá)載體 pGEX－6P－1，轉(zhuǎn)化到E．coliTOP10中，送美國(guó)Invitrogen公司中國(guó)分部測(cè)序。

（二）重組質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

把測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E．coli Rosetta中，準(zhǔn)備表達(dá)重組蛋白。挑單克隆于5ml含50μg／ml氨芐青霉素的LB（lysogeny broth，溶菌肉湯）培養(yǎng)基中過(guò)夜活化培養(yǎng)，第二天以1∶100的體積接種到200ml含50μg／ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600＝0．5～0．6時(shí)，加入終濃度為0．4mmol／L的IPTG，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。

（三）重組蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定

1．免疫印跡鑒定：取大約1個(gè)A600量（1×109）的菌，超聲破菌（100W 功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進(jìn)行5min），4℃，20 000g離心15min，分開上清液和沉淀；為了檢測(cè)目的蛋白在上清（可溶）還是沉淀（包涵體）中，上清和沉淀分別加入等量的電泳上樣緩沖液，沸水浴煮6min。取5μl進(jìn)行SDS－PAGE（十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠）電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)膜（15V，45min）。轉(zhuǎn)印后的PVDF（聚偏氟乙烯）膜用含5%脫脂奶粉的PBS（磷酸鹽緩沖液）室溫封閉1h，anti－GST單抗1∶2000室溫標(biāo)記1h，HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗1∶5000標(biāo)記1h，加入ECL液顯影。

2．考馬斯亮藍(lán)染色鑒定：純化蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳后的SDS－PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染液過(guò)夜染色，然后用脫色液脫色至條帶清晰出現(xiàn)。

3．表達(dá)產(chǎn)物的純化：3000g離心10min，收集誘導(dǎo)后的菌體，10ml含2mmol PMSF的PBS重懸，超聲破菌（100W功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進(jìn)行5min）；4℃，20 000g離心15min，上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠，4℃孵育12h。4℃，500g離心5min收集微珠，用含1%tritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚－100）的PBS液洗3次，最后用含10mmol／L還原性谷胱甘肽的50mmol／L pH8．0的Tris－HCl（三羥甲基氨基甲烷）洗脫蛋白。

結(jié) 果

1．Rv3803c、Rv3846基因擴(kuò)增結(jié)果：以 H37Rv為模板，分別擴(kuò)增得到大約900bp、600bp的基因片段（圖1），與Rv3803c、Rv3846基因的理論值相符。限制性內(nèi)切酶消化后，連接到pGEX－6p－1載體上，構(gòu)建pGEX－Rv3803c、pGEX－Rv3846重組質(zhì)粒。測(cè)序后與H37Rv比對(duì)顯示：重組質(zhì)粒Rv3803c、Rv3846編碼基因與H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

圖1 A：Rv3803c基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（900bp）；B：Rv3846基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（620bp）

2．GST－Rv3803c和 GST－Rv3846重組蛋白在E．coli中表達(dá)的可溶性分析：含有重組質(zhì)粒的E．coli Rosetta用1mmol IPTG 誘導(dǎo)后，超聲破碎菌，20 000g離心15min，分開上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體），等體積加入上樣緩沖液，Western blot鑒定。GST－Rv3803c和 GST－Rv3846兩個(gè)重組蛋白在上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體）中的含量大致相等（圖2），故其在E．coli Rosetta中的存在形式均為可溶部分約50%，包涵體形式約50%，相對(duì)分子質(zhì)量分別約為56 000和45 000。

圖2 GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白在E．coli中表達(dá)的可溶性分析

3．重組蛋白純化結(jié)果鑒定：含有重組質(zhì)粒的E．coli Rosetta誘導(dǎo)并超聲破碎的上清液與Glutathione Sepharose 4B微珠孵育，親和純化目的重組蛋白。純化后的目的重組蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色（圖3A）和 Western blot（圖3B）鑒定。有完整的融合蛋白被純化出來(lái)，純化的GST－Rv3803c、GST－Rv3846樣品純度90%以上，但由于GST－Rv3803c純化后降解較嚴(yán)重，最終只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST－Rv3803c的濃度大約為0．1mg／ml，完整的GST－Rv3846的濃度大約為0．5mg／ml。相當(dāng)于每升E．coli Rosetta培養(yǎng)物中，GST－Rv3803c產(chǎn)量為：0．25mg／L、GST－Rv3846產(chǎn)量為1．25mg／L。

圖3 A：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定；B：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及 Western blot鑒定

討 論

近年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白的相關(guān)研究一直備受關(guān)注。目前對(duì)多種分泌性蛋白的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期分泌的蛋白，如MPT51、SodA等在結(jié)核感染免疫中發(fā)揮了重要作用，為構(gòu)建保護(hù)性疫苗提供了新的思路。

MPT51蛋白的編碼基因是Rv3803c，又稱fbpC1。其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000，是一種非催化性的α／β水解酶，且與Ag85復(fù)合體有較高同源性。MiKi等［5］報(bào)道，MPT51可在小鼠的脾細(xì)胞中介導(dǎo)Ⅰ型細(xì)胞免疫。Bethunaickan等［6］以重組Rv3803c為抗原對(duì)結(jié)核患者IgG、IgA、IgM水平進(jìn)行檢測(cè)，IgG特異度為98%，IgG＋I(xiàn)gA敏感度為71%，均顯著高于健康對(duì)照組，具有一定的診斷價(jià)值。Siev等［7］發(fā)現(xiàn)，HIV感染和未感染的結(jié)核和非結(jié)核患者中，抗MPT51的抗體檢測(cè)在血清和血漿樣品中顯著相關(guān)。此外，MPT51作為候選蛋白在構(gòu)建疫苗中的免疫學(xué)作用也受到關(guān)注。Silva等［8］發(fā)現(xiàn)重組MPT51／CpG的DNA疫苗接種能夠?yàn)榻Y(jié)核感染小鼠模型提供一定的保護(hù)作用。Wang等［9］的研究也表明，其在結(jié)核感染中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。因此，純化出MPT51，可為進(jìn)一步探討其輔助診斷價(jià)值、構(gòu)建保護(hù)性疫苗等做出必要準(zhǔn)備。

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧微生物普遍存在的一種催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的金屬酶。結(jié)核分枝桿菌中有2種SOD，其中SodA由Rv3846基因編碼，對(duì)病原體有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)SodA的分泌依賴一種輔助分泌因子Sec2，此種Sec2依賴性的蛋白輸出方式參與某種特異性分泌系統(tǒng)，是結(jié)核分枝桿菌逃避宿主Mφ氧化攻擊的毒力機(jī)制之一［10］。結(jié)核感染動(dòng)物模型中，降低結(jié)核分枝桿菌SOD的產(chǎn)生，可加快單核細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡，提示SOD在結(jié)核致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。Khera等［12］發(fā)現(xiàn)表達(dá) SOD 的 DNA 疫苗能產(chǎn)生較高水平的IFN－γ，且保護(hù)作用最強(qiáng)。新近文獻(xiàn)報(bào)道，SodA在BCG中的過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致BCG的免疫效力喪失［13］。以上各項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明純化鑒定分泌抗原SodA，對(duì)深入研究SodA的分子致病機(jī)制，探討其作為疫苗候選蛋白的可能性建立了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究以pGEX－6P－1為載體，在E．coli Rosetta菌中誘導(dǎo)表達(dá)，其補(bǔ)充了E．coli缺乏的6種稀有密碼子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，可明顯提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。采用GST標(biāo)簽親和層析法成功純化出了GST－Rv3803c和GST－Rv3846蛋白，以期進(jìn)一步探討結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白MPT51、SodA在與宿主巨噬細(xì)胞相互作用時(shí)，Toll樣受體、細(xì)胞凋亡等相關(guān)信號(hào)通路變化，以及細(xì)胞因子相關(guān)免疫平衡等分子免疫機(jī)制及其在結(jié)核防治轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

［1］World Health Organisation． Global tuberculosis control：WHO report 2011［R／OL］．World Health Organization，2011［2012－04－20］．http：／／www．who．int／tb／publications／global＿report／2011／gtbr11＿full．pdf．

［2］吳雪瓊．新型結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)．中國(guó)防癆雜志，2012，34（3）：133－137．

［3］Ramalingam B，Baulard AR，Locht C，et al．Cloning，expression，and purification of the 27kDa（MPT51，Rv3803c）protein ofMycobacterium tuberculosis．Protein Expr Purif，2004，36（1）：53－60．

［4］Harth G，Horwitz MA．Export of recombinantMycobacterium tuberculosissuperoxide dismutase is dependent upon both information in the protein and mycobacterial export machinery．A model for studying export of leaderless proteins by pathogenic mycobacteria．J Biol Chem，1999，274（7）：4281－4292．

［5］Miki K，Nagata T，Tanaka T，et al．Induction of protective cellular immunity againstMycobacterium tuberculosisby recombinant attenuated self－destructing listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmids for antigen 85 complex and MPB／MPT51．Infect Immun，2004，72（4）：2014－2021．

［6］Bethunaickan R，Baulard AR，Locht C，et al．Antibody response in pulmonary tuberculosis against recombinant27kDa（MPT51，Rv3803c）protein ofMycobacterium tuberculosis．Scand J Infect Dis，2007，39（10）：867－874．

［7］Siev M，Yu X，Prados－Rosales R，et al．Correlation between serum and plasma antibody titers to Mycobacterial antigens．Clin Vaccine Immunol，2011，18（1）：173－175．

［8］Silva BD，da Silva EB，do Nascimento IP，et al．MPT－51／CpG DNA vaccine protects mice againstMycobacterium tuberculosis．Vaccine，2009，27（33）：4402－4407．

［9］ Wang LX，Nagata T，Tsujimura K，et al．Identification of HLA－DR4－restricted T－cell epitope on MPT51protein，a major secreted protein derived fromMycobacterium tuberculosisusing MPT51overlapping peptides screening and DNA vaccination．Vaccine，2010，28（8）：2026－2031．

［10］Braunstein M，Espinosa BJ，Chan J，et al．SecA2functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence ofMycobacterium tuberculosis． Mol Microbiol，2003，48（2）：453－464．

［11］Edwards KM，Cynamon MH，Voladri RK，et al．Iron－cofactored superoxide dismutase inhibits host responses toMycobacterium tuberculosis．Am J Respir Crit Care Med，2001，164（12）：2213－2219．

［12］Khera A，Singh R，Shakila H，et al．Elicitation of efficient，protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis．Vaccine，2005，23（48／49）：5655－5665．

［13］Jain R，Dey B，Khera A，et al．Over－expression of superoxide dismutase obliterates the protective effect of BCG against tuberculosis by modulating innate and adaptive immune responses．Vaccine，2011，29（45）：8118－8125．