低溫厭氧氨氧化生物濾池群落結構分析

曾濤濤，李 冬，邱文新，曾輝平，劉 濤，張 杰，

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室，100124北京)

與傳統硝化－反硝化工藝相比，厭氧氨氧化(anaerobic ammonia oxidation，ANAMMOX)具有需氧量低、污泥產量低和無需外加碳源等優點［1］，是目前最簡捷的廢水生物脫氮途徑.厭氧氨氧化的推動者——厭氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉狀菌，屬于自養型革蘭氏陰性細菌.迄今為止，通過分子生物學檢測手段已經在不同生態系統中鑒定了5種不同的“Candidatus”Anammox菌屬.

目前，ANAMMOX工藝研究主要是針對污泥消化回流液和垃圾滲濾液等高溫高氨氮廢水方面［2］，反應器也以 UASB 類型為主［3］，而對于低溫厭氧氨氧化生物濾池的研究較少，相應的微生物研究更是缺乏.本課題組已成功啟動了上流式厭氧氨氧化生物濾池，脫氮效果良好，并進行了厭氧氨氧化影響因素實驗［4－5］.與厭氧氨氧化最適溫度30～40℃相比，在較低溫度下(16℃左右)的厭氧氨氧化研究通常用低溫厭氧氨氧化表示［6］.本研究對在低溫(15.0～16.5℃)穩定運行的兩個上流式厭氧氨氧化生物濾池取樣，通過掃描電鏡(SEM)、變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)和克隆測序等方法對微生物群落結構進行分析，探索不同填料生物濾池微生物多樣性之間的關系，為促進厭氧氨氧化菌生長、提高反應器效能提供依據.

1 實驗

1.1 反應器裝置

試驗裝置為有機玻璃加工而成、相同大小的兩個生物濾柱，內徑185mm，高度2.0m，有效容積45 L.采用易于接種掛膜的陶粒和火山巖作為填料，其主要性能參數如表1所示.B1柱內裝填表面多微孔的陶粒填料，B2柱內裝填輕質多孔、表面粗糙的火山巖填料.兩個反應器均通過接種厭氧氨氧化污泥啟動成功，在自來水中通過添加硫酸銨與亞硝酸鈉配置實驗用水，使得m(NH+-N)∶m(NO－42-N)約為1∶1.31，以符合厭氧氨氧化反應基質比例要求，氨氮質量濃度約200mg/L.另外添加1.5%的生活污水A/O(厭氧/好氧)除磷工藝的二級處理出水［7］.反應器內pH 保持在7.4～8.2，溫度為冬季室內自然溫度(15.0～16.5℃).

表1 兩種填料的主要性能參數

1.2 生物膜樣品電鏡(SEM)觀察

收集B1與B2厭氧氨氧化生物膜0.5 g，加入2.5%(體積分數)的戊二醛，置于4℃冰箱中固定4h;用0.1mol/L，pH為8.0的磷酸緩沖溶液沖洗3次，每次10min;分別用30%，50%，70%，90%(體積分數)的乙醇進行脫水，每次15min，再用無水乙醇脫水3次，每次15min;然后加入體積比為1∶1的100%乙醇和乙酸異戊酯及純乙酸異戊酯各一次進行置換，每次15min;樣品真空干燥后噴金，通過掃描電鏡(HITACHIS－4300)觀察生物膜形態.

1.3 變性凝膠梯度電泳

1.3.1 總DNA提取

取200mL生物膜水樣，12000×g，4℃離心10min，收集沉淀.沉淀加入10mL，0.1mol/L的磷酸緩沖液(PBS，pH8.0)重懸2次.總DNA提取參考文獻［8］進行，之后進行純化回收.

1.3.2 PCR擴增

對大多數細菌16SrRNA基因V3區，采用通用引物BSF338-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGCACGGGGGG ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)(下劃線部分為“GC”夾)和 BSR518(ATTACCGCGGCGCTGG)進行擴增［9］.對于厭氧氨氧化16S rRNA基因，采用特異性引物 Amx368-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGC GGGGCGGGGCACGGGGGGCCTTTCGGGCATTGCGAA－3’)(下劃線部分為“GC”夾)和 Amx820(AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC)［10］進行擴增.兩種引物PCR反應體系及擴增條件相同.反應體系組成為:DNA模板1.0μL，10×Buffer2.5μL，dNTPs(2.5mmol·L-1)2.0μL，上游引物和下游引物(20μmol·L-1)各0.5μL，ExTaq酶(5U/μL)0.125μL，補水至終體積為25μL.PCR擴增條件為:94℃，5min;94℃，40s，55℃，40s，72℃，1min，35個循環;72℃，10min.PCR產物采用DNA純化回收試劑盒(天根，中國)純化回收.

1.3.3 DGGE及其結果分析

利用DGGE電泳對PCR產物進行分離，儀器為D-Code System(Bio-Rad公司)，電泳條件為:凝膠變性梯度30%～60%，聚丙烯酰胺質量分數分別為8%(BSF338-GC/BSR518擴增產物)和6%(amx368-GC/amx820擴增產物)，電壓120V，電泳緩沖液為1×TAE，電泳溫度60℃，電泳時間分別為5h(BSF338-GC/BSR518擴增產物)和8h(amx368-GC/amx820擴增產物).電泳結束后，凝膠進行銀染［11］，通過凝膠成像儀(BioRad，Gel Doc XR)獲取圖像.

為了解生物濾池反應器中微生物群落結構，通過軟件Quantity One 4.6.0(Bio-Rad，USA)對DGGE圖譜進行分析，其中微生物群落多樣性用Shannon-Weaver指數 (H)表示［12］，相關性分析主要分析不同填料反應器內細菌種群的相似性，用Sorenson配對比較相似性系數(Cs)表示.

1.4 微生物系統發育分析

對于細菌及厭氧氨氧化DGGE凝膠上條帶進行切膠溶于100μL1×TE中，4℃，16h.以此為模板，相應不帶GC夾的BSF338/BSR518及amx368/amx820為引物，擴增細菌及厭氧氨氧化細菌16SrRNA片段.將純化回收的PCR產物連接到載體pMD19-T(TaKaRa)上，并轉化到感受態細胞Escherichia coli DH5α(天根，中國)中.陽性克隆送交上海生工生物公司(中國)進行測序.

獲得的序列通過NCBI網站的BLAST工具搜索相近序列，并進行比對.通過MEGA4.1軟件，以bootstrap-NJ法構建系統進化樹.本研究所測得的ANAMMOX菌16SrRNA序列已提交至GenBank，登錄號為JN244671.

2 結果與討論

2.1 微生物形態

兩個反應器啟動成功后穩定運行1個月，B1反應器平均總氮去除負荷為0.5kg/(m3·d)，去除率為50%;B2平均總氮去除負荷1.6kg/(m3·d)，去除率為60%.兩個生物濾柱填料表面都形成紅色生物膜，這正是anammox菌獨特的顏色特征.其中B1反應器生物膜紅色比較淺，分布稀疏;B2反應器生物膜紅色比較深，分布稠密.生物膜微觀結構通過掃描電子顯微鏡觀察，結果見圖1.

圖1 厭氧氨氧化生物膜掃描電鏡照片

比較B1和B2掃描電鏡結果，發現B1反應器生物膜特點是絲狀菌比較多，球形細菌分布密度較低.而B2反應器生物膜特點是以球形細菌為主，存在少量卵狀、桿狀細菌，沒有發現絲狀菌的存在.絲狀菌一般為異養細菌，比自養菌繁殖速度快［13］，本文認為絲狀菌的大量繁殖會優先占據反應器內填料表面及其空隙，不利于自養菌anammox菌的生長與附著，因而會影響反應器的脫氮效果.這可能是B1反應器總氮去除負荷(0.5 kg/(m3·d))遠低于B2反應器(1.6kg/(m3·d))的原因.已報道的典型厭氧氨氧化細菌形態為球形，直徑在0.8～1.1μm［14］.兩個厭氧氨氧化反應器內都發現這種球形細菌的存在，推測可能是厭氧氨氧化細菌.B2反應器球形細菌分布更為密集，推測原因是火山巖填料比陶粒填料具有更大的空隙率與孔隙率，更有利于這種微生物的富集.

2.2 微生物群落結構

對銀染后的DGGE凝膠進行成像，在兩條泳道上共觀察到12條不同的條帶，見圖2(a);圖2(b)是對DGGE照片經過Quantity One 4.6.0分析后繪制的DGGE圖譜示意圖，12條橫線位置及橫線顏色深淺可以簡單反映各條帶的分布與相對強度.微生物群落多樣性指數H1、H2分別為1.258和1.276.圖2(c)是ANAMMOX細菌DGGE結果.對圖2(a)中12個條帶進行切膠、PCR擴增，克隆測序鑒定，結果見表2.

圖2 兩種厭氧氨氧化生物膜DGGE結果比較

由圖2(a)可見，B1和B2中的微生物種類豐度不是很高，這可能與反應器進水采用無機配水有關［15］.H2略大于H1，表明B2反應器微生物多樣性更高，火山巖填料(B2)比陶粒填料(B1)更有利于微生物富集.B1和B2反應器內細菌種群的相似性為68.1%，表明不同填料ANAMMOX反應器內微生物種類有所差別.DGGE結果中(圖2(a))，B1總共有8個條帶，B2有10個條帶，兩個反應器有6個條帶在相同位置(6、7、8、9、10 和12)，表明這6 種微生物在兩個反應器內都存在，分別與Candidatus Kuenenia stuttgartiensis(AF375995)、Ignavibacterium album(AB478415.1)、Hippea maritime(AB072402.1)、Acinetobacter sp.＇Acinet.1＇(EF409307.1)、Sulfuroxidizing bacterium gps61 (AB266389.1)及Rhodopseudomonas palustris(D12700.1)最相似(表2).兩反應器內具有厭氧氨氧化作用的為條帶6所代表的Candidatus Kuenenia stuttgartiensis，其他為污水處理系統常見微生物.這表明兩個反應器雖然填料不同，但經過較長時間運行后，能富集到同一種厭氧氨氧化細菌.

表2 厭氧氨氧化反應器內細菌16S rRNA測序結果

條帶5與條帶11只出現在B1反應器內，它們與Anaerobic bacterium MO-CFX2(AB598278.1)和Rhodopseudomonas palustris(D12700.1)最相似，相似度分別為96%和93%，表明這兩種細菌更容易在陶粒填料生物濾柱(B1)內生長.而條帶1、2、3和4僅出現在B2反應器內，它們與Oxalicibacterium sp.JCN-21(GU295961.1)、 Oxalicibacterium sp.JCN-21(GU295961.1)、Thermomonas hydrothermalis strain SGM-6(NR025265.1)和 Anaerobicammonium-oxidizing planctomycete KOLL2a(AJ250882.1)相似度分別為93%、91%、88%及89%，表明這4種細菌更容易在火山巖填料生物濾柱(B2)內生長.兩種反應器內存在不同的細菌，這可能與填料性質相關，因為火山巖填料具有更好的孔隙度，因而能富集更多的細菌.

雖然B1和B2生物濾池的填料不同，但在連續運行過程中，二者的操作條件基本相同.圖2(c)中兩組泳道都只有一個條帶且位置相同，表明長時間運行后，兩個反應器中存在同一類厭氧氨氧化菌，細菌16S rRNA克隆測序也發現兩個反應器內ANAMMOX菌同為Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.大多數對于廢水處理厭氧氨氧化菌的研究發現，雖然不同反應器內ANAMMOX菌屬可能不同，但其種類比較單一，以某一種為主［16］，這可能與進水水質及運行工況相關，而Candidatus Kuenenia stuttgartiensis比較容易在生物濾池形式的反應器內出現［14］.

2.3 厭氧氨氧化細菌系統發育分析

因為細菌16SrRNAV3區片斷較短(約180bp)，信息量較少，為了更詳盡地了解反應器內ANAMMOX菌種類，對ANAMMOX菌DGGE條帶(約480bp)進行切膠回收、PCR重擴增和克隆測序.將該序列與其他相關細菌的16SrRNA序列，通過MEGA4.1軟件構建系統發育樹，如圖3所示.

圖3 厭氧氨氧化細菌的系統發育樹分析

圖3代表生物濾池中厭氧氨氧化細菌和已知的5類厭氧氨氧化細菌及相關浮霉狀菌的系統發育關系.序列 JN244671與 Candidatus Kuenenia stuttgartiensis(AF375995)同源性最高，相似度達99%.同時，與 Anaerobic ammonium-oxidizing planctomycete KOLL2a(AJ250882.1)在同一個分支上，顯示它們在進化關系上最為接近.Candidatus Kuenenia stuttgartiensis最早發現于生物濾池中［14］，通過環境基因組方法，已經完成全基因組測序［17］，這為研究厭氧氨氧化細菌提供了新的藍圖.Candidatus Kuenenia stuttgartiensis菌體呈球狀，直徑1 μm左右，化能自養型，具有典型的厭氧氨氧化菌細胞結構特征，本實驗中觀察到的厭氧氨氧化菌與這些特征十分吻合.

已報道的大多數厭氧氨氧化反應器操作溫度保持在30～40℃［2］，而一般廢水的溫度都處于常溫(25℃)或更低溫度，在實際污水處理中，對廢水進行加熱和保溫成本太高也不實際，這成為厭氧氨氧化工藝應用的一個難題.本研究中，火山巖填料厭氧氨氧化生物濾池(B2)在較低溫(15.0～16.5℃)條件下脫氮效果良好;另外，反應器長時間運行中，一直在室內自然光線環境中，并不需要嚴格黑暗避光，這對 CandidatusKuenenia stuttgartiensis的認識更深了一步.綜合研究表明，可以采用火山巖填料填充生物濾池反應器，并富集Candidatus Kuenenia stuttgartiensis，有助于厭氧氨氧化工藝在較低溫度(15.0～16.5℃)條件下穩定運行，從而節省廢水加熱與保溫費用.

3 結論

1)SEM結果顯示，陶粒填料反應器(B1)內絲狀菌比較多，球形細菌分布密度較低，火山巖填料反應器(B2)沒有發現絲狀菌，而球形細菌分布密集.絲狀菌的存在不利于anammox菌的生長，火山巖填料更有利于球形細菌的富集.

2)細菌DGGE結果表明，不同填料反應器內微生物種類有所差別，B1和B2細菌種群的相似性僅為68.1%，B2反應器內細菌豐度更高.雖然B1和B2填料不同，但經過較長時間運行后，能富集到同一種厭氧氨氧化細菌.

3)通過細菌及厭氧氨氧化細菌DGGE條帶16S rRNA克隆測序，鑒定反應器內功能微生物為厭氧氨氧化菌Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.可以采用火山巖填料生物濾池反應器形式，通過富集Candidatus Kuenenia stuttgartiensis，有助于厭氧氨氧化工藝在較低溫度(15.0～16.5℃)下穩定運行，從而節省廢水加熱與保溫費用.

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