高效液相色譜法測定濃縮果汁及水果果糖中羥甲基糠醛

孔祥虹，李小軍，何 強(qiáng)，高軍剛，吳雙民

(1.陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局，陜西西安710068;2.陜西師范大學(xué)，陜西西安710062)

羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde，5-HMF)是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸性條件下脫水產(chǎn)生的酚醛類化合物，其為黑色，具有難聞氣味，是引起食品風(fēng)味和褐變的指標(biāo)成分之一。它常存在于濃縮果汁中，是己糖在高溫或酸性等條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)和熱降解反應(yīng)(即焦糖化褐變)脫水產(chǎn)生的［1］。若5-羥甲基糠醛濃度偏高，表明加工過程中受到過度加熱，果汁的色值變小，口感變差，因此它也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)果汁品質(zhì)的重要標(biāo)志之一［2］。5-羥甲基糠醛具有多方面的對(duì)人體有害的生理作用而受到廣泛關(guān)注，有報(bào)道稱，它對(duì)眼睛、黏膜、皮膚均有刺激性，過量食用會(huì)引起中毒，造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害［3］。近年來，我國蘋果、梨、葡萄等果汁產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，濃縮蘋果汁年產(chǎn)量約65萬t，其中約有90%用于出口，占世界濃縮蘋果汁的30%，已成為世界濃縮蘋果汁的主要生產(chǎn)國和出口國。目前，國際上對(duì)果汁中5-羥甲基糠醛的含量無統(tǒng)一的限量規(guī)定，歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會(huì)(AIJN)規(guī)定果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為20mg/L;國際果汁加工聯(lián)合會(huì)(IFFJP)建議果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為5～10mg/L，濃縮果汁中最大殘留限量為25mg/L［4］。目前，5-羥甲基糠醛的測定方法主要有紫外分光光度(UV)法［5］、高效液相色譜(HPLC)法［6］、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法［7］等。UV法靈敏度和準(zhǔn)確性相對(duì)較低，HPLC法樣品前處理簡單靈敏度和相對(duì)較高，而HPLCMS/MS法儀器昂貴，難以普及。以往的研究多集中于高效液相色譜法測定黃酒［8］、牛乳［9］、醬油［10］等食品中的5-羥甲基糠醛，但未見HPLC法檢測濃縮蘋果汁及濃縮水果果糖中5-羥甲基糠醛的報(bào)道，本研究在HPLC法的基礎(chǔ)上建立一種能夠快速、準(zhǔn)確測定濃縮果汁及水果果糖中5-康甲基糠醛的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃縮果汁、水果果糖(濃縮果汁中提取出來)購自陜西某果汁廠;5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr公司;甲醇 HPLC級(jí);其他試劑均為分析純。

2695e型高效液相色譜儀、2489UV/Visibie紫外檢測器 美國Waters公司;Milili-Q Advantage A10/Elix超純水系統(tǒng) 法國Millipore公司。

1.2 對(duì)照品溶液的制備

取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品25.0mg，精密稱定，置于50mL棕色容量瓶中，以10mL甲醇溶解后，用水稀釋定容至50mL，配成0.50mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并用水稀釋配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取試樣5g(精確至0.001g)，置于50mL燒杯中，加入10mL甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，充分混勻。取少量樣液過0.45μm的濾膜，即得。

1.4 色譜條件

色譜柱:Inetrsil ODS-3 C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相∶甲醇-水(8∶92，V/V)，流速 1.0mL/min，檢測波長:282nm，柱溫:35℃，進(jìn)樣量:10μL。

1.5 5－羥甲基糠醛的定性、定量分析

根據(jù)5-羥甲基糠醛的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。定量分析采用外標(biāo)法定量，依次配制不同濃度的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到濃度與峰面積的線性關(guān)系，利用線性方程及稀釋倍數(shù)計(jì)算定量結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相和流速的選擇 流動(dòng)相考察了水-甲醇、0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-甲醇、0.01mol/L乙酸銨溶液-甲醇，作流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，磷酸二氫鉀和乙酸銨使色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而且鹽會(huì)損壞色譜柱而導(dǎo)致柱效降低、基線嚴(yán)重漂移，故選定水和甲醇為流動(dòng)相，通過調(diào)整流動(dòng)相的比例發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-水(8∶92，V/V)時(shí)(如圖 1～圖 2)，5-羥甲基糠醛峰形和分離度均可達(dá)到要求。此外，對(duì)比0.8、1.0、1.5mL/min 3種流速效果后，最終選定1.0mL/min為最佳流速，可獲得比較理想的分離效果及合適的分析時(shí)間。

圖1 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 5-HMF standard

圖2 濃縮蘋果汁中5-羥甲基糠醛的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-HMF in sample

2.1.2 色譜柱和柱溫的選擇 5-羥甲基糠醛屬于中等極性化合物，為了分離度和鋒形的改善，本方法分別采用 Diamonsil C18色譜柱(250mm ×4.6mm，5μm)、ZORBAX Eclipse XDB-C18(250mm ×4.6mm，5μm)和 Inetrsil ODS-3 C18色譜柱(250mm ×4.6mm，5μm)柱進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Inetrsil ODS-3 C18色譜柱，可以較好的分離樣品中的5-羥甲基糠醛。比較了25、30、35℃時(shí)5-羥甲基糠醛的色譜圖，發(fā)現(xiàn)柱溫在35℃時(shí)峰形比25、30℃時(shí)的較好。

2.1.3 進(jìn)樣量的選擇 通過比較進(jìn)樣量分別為5、10、15、20μL 的分離效果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量過大時(shí)，色譜峰會(huì)出現(xiàn)拖尾峰或者前延峰，而且分離效果不佳。若進(jìn)樣量太少，響應(yīng)低，檢測不到，所以最終確定進(jìn)樣量為10μL。

2.1.4 色譜條件的確定 由以上實(shí)驗(yàn)，最終確定的色譜條件是:檢測波長:282nm，柱溫:35℃，進(jìn)樣量為10μL，流動(dòng)相為甲醇-水(8∶92，V/V)。

2.2 分析方法評(píng)價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取適量的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至50mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，配成 1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣2次，以5-羥甲基糠醛的平均峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液中物質(zhì)的含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。得到的線性回歸方程為 Y=65594X+14305，r=0.9998，結(jié)果表明，在1.0～25.0mg/L范圍內(nèi)，5-羥甲基糠醛的質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

圖3 5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of 5-HMF

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見表1。取同一標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在相同的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中5-羥甲基糠醛峰面積，計(jì)算5-羥甲基糠醛峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)1.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品共6份，按1.3節(jié)的方法制備樣液，得到樣液按2.1.4項(xiàng)下的色譜條件測定，結(jié)果測得5-羥甲基糠醛的平均含量為9.46mg/L，RSD為1.63%(n=6)，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加標(biāo)回收率和檢出限 選擇同一濃縮蘋果汁和濃縮梨汁樣品，分別加入一定量5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按1.3節(jié)方法處理，依法測定，計(jì)算回收率結(jié)果見表1。在信噪比(S/N)=3∶1，進(jìn)樣體積10μL時(shí)，濃縮蘋果汁、濃縮梨汁、水果果糖中的5-羥甲基糠醛的檢出限均為0.2mg/kg。

表1 5-羥甲基糠醛平均的回收率(n=6)Table 1 Average recoveries of 5-HMF(n=6)

2.5 試樣檢測

利用本文建立的方法對(duì)陜西某果汁廠提供的10份樣品進(jìn)行檢測，該方法對(duì)這些樣品均具有良好的適用性，色譜無干擾，在所檢樣品中均未超過國際果汁加工聯(lián)合會(huì)(IFFJP)建議的果汁中最大殘留限量。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定食品中5-羥甲基糠醛。該方法具有樣品前處理簡單快速、分離度高、回收率高、重復(fù)性好和適用性良好等特點(diǎn)，滿足濃縮蘋果汁、濃縮梨汁和水果果糖中5-羥甲基糠醛的測定要求，可作為快速測定濃縮蘋果汁等產(chǎn)品中5-羥甲基糠醛的方法。

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