茉莉酸甲酯處理抑制鮮切梨褐變機理的研究

王艷穎，胡文忠，* ，姜 波，金黎明

(1.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600;2.生物化學工程國家民委-教育部重點實驗室，遼寧大連116600)

鮮切果蔬又稱最少加工處理(mini-processed)果蔬，是指新鮮果蔬原料經過挑選、清洗、去皮、切分、保鮮、包裝等處理，并使產品保持新鮮狀態的制品，由于鮮切果蔬具有新鮮、安全、方便等優點，因而深受消費者喜愛［1］。然而，與新鮮完整果蔬相比，鮮切果蔬由于加工過程中的切分，造成機械損傷，導致細胞破裂，膜透性增加，酚類物質和多酚氧化酶(PPO)迅速接觸而導致果實發生酶促褐變，同時，自由基平衡系統受到破壞，膜脂過氧化加劇，造成果實衰老加速，使產品色澤、質地、風味下降，降低了鮮切果蔬的商品價值［2-4］，因而探索如何防止鮮切果蔬品質劣變的保鮮技術至關重要。茉莉酸類物質(JAs)包括茉莉酸(jasmonic acid，JA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonic acid，MeJA)，是植物天然產生的生長調節物質，廣泛存在于植物界中。研究結果表明，茉莉酸(酯)類物質是與抗性密切相關的植物生長物質。作為內源信號分子參與植物在機械傷害、病蟲害、干旱、鹽脅迫、低溫等條件下的抗逆反應。當植物受到傷害時，植物體內茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，進而誘導一系列與抗逆有關的基因表達，如蛋白酶抑制劑、苯丙氨酸轉氨酶(PAL)等［5］。目前國內有關茉莉酸甲酯在鮮切果蔬方面的研究很少，尤其缺乏果蔬褐變機理方面的研究，所以，本文采用茉莉酸甲酯處理鮮切水晶梨，研究其處理后鮮切梨酶促褐變的機制，從而為鮮切果蔬的保鮮加工技術提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試的水晶梨 購于當地超市，挑選果形整齊，大小均勻，無病蟲害及機械損傷，色澤、成熟度一致的果實。

電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;電導率儀 美國Thermo electron corporation;BR4i型高速冷凍離心機 法國Jouan;SiM-F140型制冰機日本三洋;T-25型勻漿機 德國IKA;UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;Lambda 25型紫外可見分光光度計 美國Perkin Elmer;CR400/CR410型色差計 日本Konica Minolta;組合式氣調庫 大連冷凍機股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 將梨果實用200μL/L的次氯酸鈉溶液浸泡5min后，再用雙蒸水多次清洗后，用鋒利的無菌刀在消毒后的菜板上去除果皮，然后將果實切成1.5cm×1.5cm的正方體小塊進行以下3組處理:處理1和處理2分別用1、10μmol/L的茉莉酸甲酯溶液浸泡5min，對照果用雙蒸水浸泡5min，各處理果晾干后分別裝入保鮮盒內置于室溫條件下貯藏。

1.2.2 相對電導率的測定 參照席玙芳的方法［6］。

1.2.3 多酚含量的測定 參照 Singleton的方法［7］，單位以OD280nm/g FW表示，重復測定3次。

1.2.4 PPO、POD活性及MDA含量的測定

1.2.4.1 提取液的制備 取10g去皮果肉，加1g PVP于20mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.4)中，冰浴研磨，4℃下13000r/min離心30min，取上清液測定酶活性和MDA含量。

1.2.4.2 PPO活性測定 參照Galeazzi等的方法［8］，酶活性以ΔOD398/min·g FW表示，樣品重復測定3次。

1.2.4.3 POD活性的測定 按照 Putter的方法［9］，酶活性以ΔOD460/min·g FW表示，樣品重復測定3次。

1.2.4.4 MDA含量的測定 參照Heath和Pacontroler的方法［10］，單位以 nmol/g FW 表示，樣品重復測定3次。

1.2.5 SOD活性的測定 采用SOD對NBT光化還原抑制的方法［11］。以抑制 NBT光化還原50%為1個酶活性單位，結果以U/g FWh表示。

1.2.6 CAT活性的測定 參照 Acbi方法［12］，CAT反應體系包括粗酶液200μL和3mL 20mmol/L H2O2，以蒸餾水作參比。在240nm處測定2min內的樣品吸光值，重復測定3次。

1.2.7 果實顏色的測定 用色差計測定。

2 結果與分析

2.1 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨相對電導率的影響

細胞質膜完整性的破壞是果實衰老的重要標志。細胞膜透性可以用相對電導率大小來衡量。如圖1所示，對照和處理果的相對電導率都呈現先上升后下降的趨勢，說明切割等機械傷破壞了梨細胞膜的結構，造成細胞汁液外滲，導致相對電導率上升。而機械傷又會引發一系列與蛋白質合成有關的代謝變化和包括細胞在內的修復過程，其中最重要的就是新膜的生物合成［13］，使組織的失水和電解質外滲得到控制，而且貯藏后期果實衰老加劇也會導致相對電導率逐漸下降。而處理組的相對電導率上升下降幅度較小，峰值比對照晚一天出現且后期明顯地高于對照。實驗結果表明，茉莉酸甲酯處理有效地保護了細胞膜結構，抑制了相對電導率的上升，從而延緩了梨組織的衰老，尤其處理1相對電導率貯藏前期最低，更有效地延緩了梨果實的衰老進程。

圖1 茉莉酸甲酯對鮮切梨相對電導率的影響Fig.1 Effect of methyl jasmonate on relative electrical conductivity of fresh-cut pear

2.2 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨多酚含量的影響

酚類物質是果實酶促褐變的底物，在多酚氧化酶的作用下氧化成醌而導致果實褐變。如圖2所示，多酚含量在貯藏期呈現前期上升后期下降的趨勢，處理果多酚含量的變化明顯地慢于對照且變化幅度較小，而且處理1在貯藏前期一直保持最低水平。可能是切割傷害破壞了細胞膜的結構，酚類物質外滲，導致多酚含量上升，隨著貯藏時間的延長，果實衰老、褐變加劇，酚類物質因消耗而逐漸減少。茉莉酸甲酯處理抑制了多酚含量的上升，減輕了梨果實酶促褐變的程度，尤其處理1效果更好。

圖2 茉莉酸甲酯對鮮切梨多酚含量的影響Fig.2 Effect of methyl jasmonate on polyphenol contents of fresh-cut pear

2.3 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨多酚氧化酶(PPO)活性的影響

多酚氧化酶(PPO)在組織細胞內以兩種形式存在，一種具有催化活性的游離態(FPPO)存在于細胞質中;一種以潛在活性的結合態(BPPO)存在于細胞膜上，果蔬一旦遭到機械損傷，造成細胞質膜的破裂，BPPO便游離出來，轉化為具有催化活性FPPO［14］。如圖3所示，對照和處理組的PPO活性都呈現先上升后下降的趨勢，處理組的PPO活性在前期明顯地低于對照。因為切割傷害破壞了細胞膜的結構，大量的FPPO游離出來導致酶活性升高，把酚類物質氧化成醌后而減少。而茉莉酸甲酯處理因有效地保護了膜結構而抑制了PPO的活性，減弱了酶促褐變的趨勢，尤其處理1貯藏前期PPO活性最低，更有效地抑制了果實的褐變，保持了鮮切梨良好的貯藏品質。

圖3 茉莉酸甲酯對鮮切梨PPO活性的影響Fig.3 Effect of methyl jasmonate on PPO activity of fresh-cut pear

2.4 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨過氧化物酶(POD)活性的影響

POD是植物在逆境條件下酶促防御系統的關鍵酶之一，它與SOD、CAT相互協調配合，清除過剩的自由基，以提高植物的抗逆性［15］。如圖4所示，鮮切梨在貯藏過程中無論是對照還是處理組POD活性都呈現上升下降的反復趨勢，處理組的POD活性變化明顯地慢于對照，活性高峰比對照晚兩天出現，尤其處理1的酶活性代謝速度最慢。因為切割傷害破壞了膜結構，導致H2O2的積累，從而誘導了POD活性的上升，以提高果實對傷脅迫的抗性，隨著貯藏時間的延長，果實衰老加劇，清除自由基能力減弱，POD活性逐漸下降;而茉莉酸甲酯處理因保護了膜結構，抑制了H2O2的積累，所以延緩了POD活性的上升，使貯藏后期鮮切梨保持了較好的貯藏品質，POD保持較高的活性，具有較強的清除自由基能力。

圖4 茉莉酸甲酯對鮮切梨POD活性的影響Fig.4 Effect of methyl jasmonate on POD activity of fresh-cut pear

2.5 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨丙二醛(MDA)含量的影響

果蔬組織中活性氧產生和清除之間的不平衡，導致活性氧的積累，從而促進膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的產物，其累積量的多少反映膜脂過氧化程度的高低［16］。如圖5所示，切割傷害導致對照果MDA含量初期快速升高后期快速下降，而處理組的MDA含量變化速度較慢，峰值與POD活性變化一致都比對照晚兩天出現。這可能是因為切割傷害破壞了鮮切梨細胞膜的結構，加速了活性氧的積累，促進了膜脂過氧化。而茉莉酸甲酯處理有效地保護了膜結構，促進了細胞保護酶及時清除過剩的自由基，抑制了膜脂過氧化的進程，從而延遲了MDA含量的上升。尤其處理1在貯藏前期MDA含量最低，膜脂過氧化進程較緩慢，更有效地保持了鮮切梨的貯藏品質。

圖5 茉莉酸甲酯對鮮切梨MDA含量的影響Fig.5 Effect of methyl jasmonate on MDA contents of fresh-cut pear

2.6 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)作為植物抗氧化系統的第一道防線，主要功能是清除細胞中多余的超氧陰離子，防止其對細胞膜系統造成傷害［17］。如圖6所示，SOD活性在貯藏過程中都呈現上升下降的趨勢，但處理組的SOD活性變化明顯地慢于對照，活性高峰比對照晚一天出現，而且后期一直保持較高的活性。分析原因可能是切割傷害破壞了梨組織自由基代謝平衡，誘導了SOD活性的升高以清除多余的超氧陰離子，隨著貯藏期的延長，組織衰老加速，清除超氧陰離子能力減弱，導致SOD活性下降;而茉莉酸甲酯處理因保護了膜結構而維持了活性氧代謝平衡，推遲了SOD清除超氧陰離子的進程。尤其處理1較對照誘導SOD活性較慢而且活性較強，對由傷脅迫和衰老導致自由基代謝不平衡而引發的膜脂過氧化起到了更有效的防御保護作用。

圖6 茉莉酸甲酯對鮮切梨SOD活性的影響Fig.6 Effect of methyl jasmonate on SOD activity of fresh-cut pear

2.7 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨過氧化氫酶(CAT)活性的影響

果實衰老源于活性氧的積累，活性氧產生和清除之間的平衡被破壞導致活性氧的積累，使果實衰老加劇。CAT能分解代謝產生的H2O2而有效地清除自由基［18］。如圖7所示，梨果實經切割后，CAT活性呈現前期上升后期下降的趨勢，它與SOD活性的變化趨勢相似，只是比SOD活性峰值晚了一天出現，處理果的CAT活性變化慢于對照且后期保持較高的活性。這可能是因為切割等機械傷誘導了鮮切梨CAT活性的上升以清除過剩自由基，它與SOD相互協調配合對受傷害的細胞起到持續保護作用。而茉莉酸甲酯處理推遲了果實的老化進程，抑制了CAT活性的快速上升，尤其處理1貯藏后期保持較高的CAT活性，仍然具有較強的清除自由基的能力，使果實保持良好的貯藏品質。

圖7 茉莉酸甲酯對鮮切梨CAT活性的影響Fig.7 Effect of methyl jasmonate on CAT activity of fresh-cut pear

2.8 茉莉酸甲酯處理對鮮切梨L*值的影響

L*值是反映果實表面褐變最直觀的指標參數，L*值越小，褐變越嚴重。由圖8可知，鮮切梨果實的顏色是逐漸下降的，但處理組的L*值下降較慢，而且始終高于對照，尤其處理1在貯期一直保持最高的水平，說明較低濃度的茉莉酸甲酯抑制鮮切梨的褐變效果最好。

圖8 茉莉酸甲酯對鮮切梨顏色L*的影響Fig.8 Effect of methyl jasmonate on colour L* of fresh-cut pear

3 結論與討論

3.1 褐變是植物組織普遍存在的一種生理現象，通常認為是酚類物質在氧的作用下，被多酚氧化酶(PPO)氧化成醌所致［3］。在正常發育的果實中，酚類物質、氧和PPO通過一系列膜系統實現區域性分布使果實不發生褐變，當細胞膜結構被破壞后，酚類物質和多酚氧化酶的區域化分布被打破，酚類物質不斷滲出與游離態的PPO接觸，從而引起果肉的酶促褐變［19］。本實驗結果表明，切割傷害破壞了梨果實細胞膜的結構，使區域化分隔狀態的酚類物質大量外溢，導致相對電導率快速上升，同時它與游離態的PPO接觸氧化而導致果實發生酶促褐變，表現為L*值逐漸下降。而茉莉酸甲酯可能誘導了如新膜等蛋白質的合成，維持了鮮切梨細胞膜的完整性，抑制了酚類物質外泄和PPO活性的上升，減弱了梨果實酶促褐變的程度，特別是1μmol/L的茉莉酸甲酯處理的效果更好，果實褐變度最輕。

3.2 SOD、POD和CAT是植物體內存在的清除自由基的保護酶，SOD主要催化的歧化反應，使·轉變成和，后者再被CAT或POD分解和。正常情況下植物體內的·處于產生與清除的動態平衡中。逆境條件破壞了自由基代謝的平衡，引起膜脂過氧化。本實驗結果表明，切割傷害破壞了自由基代謝的平衡，果肉組織中的保護酶(SOD、POD、CAT)不能及時清除代謝產生的過剩自由基，引起膜脂過氧化加劇，表現為MDA含量的上升。同時傷脅迫逐漸地誘導細胞保護酶活性的增強，提高果實清除自由基的能力，說明鮮切梨果實的保護酶系統在抵抗逆境脅迫方面具有一定的相互協同作用。茉莉酸甲酯處理因為有效地保護了膜結構而抑制了活性氧的積累，延緩了各種保護酶活性的快速增加，推遲了膜脂過氧化的進程。另外，在處理組的果實開始衰老時，茉莉酸甲酯也可能參與誘導SOD、POD、CAT等細胞保護酶活性以進一步提高對傷脅迫的抗性，使果實保持更好的貯藏品質。尤其1μmol/L的茉莉酸甲酯處理更有效地降低了膜脂過氧化的速度，延遲了果實的衰老進程，保持了鮮切梨更好的貯藏品質。

［1］邵遠志，李雪萍，陳嬌，等.切割方式和包裝方法對鮮切菠蘿品質及生理特性的影響［J］.食品科學，2011，32(2):266-269.

［2］李穎，王紅育.生鮮預分切果蔬保鮮方法的研究進展［J］.食品科學，2008，29(10):645-648.

［3］Kevin Robards，Paul D prezler，Greg Tucker，et al.Phenolic compounds and their role in oxidatibe processes in fruits［J］.Food Chemistry，1999，66:401-436.

［4］王森，謝碧霞.梨果肉褐變機理和防褐變技術的研究［J］.北方果樹，2004(5):4-7.

［5］CHEONG JJ，YANG DD.Methyl jasmonate as vital substance in plant［J］.Trends in Genetics，2003，19(7):409-413.

［6］席玙芳，鄭永華，應鐵進.楊梅果實采后的衰老機理［J］.園藝學報，1994，21(3):213-216.

［7］Singleton V L，Rossi J A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1965，16(3):144-158.

［8］Galeazzi M A M，Sgarbieri N，Costantinides，et al.Purifilation and physiochemicl characterization of phenol oxidase from dwarf variety of banana(Musa cavendishii)［J］.Food Sci，1981，46:150-155.

［9］Putter J，Peroxidase.In Methods of Enzymatic Analysis［M］.New York:Academy Press，1974:685-689.

［10］Heath R T，Pacontroler L.Photoperoxidation in isolated Chloroplasts.I.Kinetics and Stoichiometry of Fatty Acid Peroxidation［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1968，125:189-198.

［11］Dhindsa R S，Dhindsa P P，Thrope T A.Leaf senescence:correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation，and decreased levels of superoxide dismutase and catalase［J］.Journal of Experimental Botany，1981，3:93-101.

［12］Acbi H.Catalase in vitro［J］.Methods Enzymol，1984，105:121-126.

［13］潘永貴，施瑞城.采后果蔬受機械傷害的生理生化反應［J］.植物生理學通迅，2000，36(6):568-572.

［14］Mayer A M，Harel E.Polyphenol oxedases in plants［J］.Phytochemistry，1979，18:193-215.

［15］Gechev T，Willekens H，Montagu M v，et al.Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress［J］.Journal of Plant Physiology，2003，160:509-515.

［16］SALS J M.Involvement of oxidative stress in chilling injury in cold stored mandarin fruit［J］.Postharv Biol Technol，1998，13:255-261.

［17］陳國剛，王禎麗，童軍茂.庫爾勒香梨采后果實褐變與多酚氧化酶、酚類物質及細胞膜結構的關系［J］.中國農學通報，2005，21(8):83-85.

［18］闞娟，金昌海，汪志君，等.梨果實后熟衰老過程中溫度對活性氧清除的影響［J］.廣州食品工業科技，2004，20(3):41-44.

［19］Tomas-Barberan FA，espin JC.Phenolic compounds and related enzymes as determinants of quality in fruit and vegetables［J］.J Scvi Food Agric，2001，81:853-876.

［20］Fry S C.Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of angiosperms［J］.Annu Rev Plant Physiol，1986，37:165-186.