蝦過敏C57/BL6小鼠動物模型的建立

黃建芳，王彩霞，向軍儉，郭 潔，呂 思

(廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，暨南大學抗體工程研究中心，廣東廣州510632)

近年來，隨著工業(yè)化程度的提高和轉基因農產品的商業(yè)化，過敏性疾病發(fā)病率呈不斷增長趨勢，食品過敏已成為全球關注的公共衛(wèi)生問題之一［1］。為此，國際食品法典委員會和一些發(fā)達國家及地區(qū)紛紛制定了食品過敏原標識法規(guī)，其中美國和歐盟已經進入強制性實施階段［2-3］。因此，對食品過敏原的檢測與安全性評價已成為食品安全研究領域一個重要的課題。診斷、檢測食品過敏原的方法分為體內實驗和體外實驗，體內實驗如皮膚實驗雖然可提供食物過敏最為直接的證據(jù)，但出于安全和倫理方面考慮，不適合大規(guī)模開展;體外實驗主要是檢測血清中特異lgE含量，此方法依賴大量過敏患者血清，并且血清IgE也不完全與過敏反應相關，無法真實反映機體的過敏狀態(tài)［4-5］。以動物模型和細胞模型為主的特異性體外定性、定量檢測技術兼?zhèn)淞梭w內實驗和體外檢測的優(yōu)點，其特異、安全、靈敏，將成為食品過敏原檢驗、檢測和評價的關鍵技術。目前國內對食物過敏動物模型和細胞模型及其評價體系的研究比較缺乏［6］。本實驗擬建立C57/BL6小鼠蝦過敏動物模型及肥大細胞組胺體外釋放模型，Western Blot分析致敏小鼠血清特異性lgE和lgG1抗體，并用蝦不同過敏原組分體外誘導致敏小鼠腹腔肥大細胞脫顆粒，分析組胺釋放率的差異，從而為建立體外過敏原檢測與評價的動物模型和細胞模型奠定基礎，為我國食品過敏原的標準化及解決食品中過敏原標識等問題提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C57/BL6小鼠 6周齡，9只，南方醫(yī)科大學實驗動物中心;HRP-山羊抗小鼠 IgE抗體 美國Bethyl公司;HRP-山羊抗小鼠 IgG1抗體 美國SouthernBiotech公司;淋巴細胞分離液 天津TBD公司;蝦過敏原蛋白 分子量21、36、80ku，由本實驗室鑒定并純化;重組塵螨蛋白Der f1 由深圳大學生命科學學院劉志剛教授惠贈;組胺標準品、牛血清白蛋白(BSA)、鄰苯二甲醛(OPT)Sigma公司;DAB底物試劑盒 Tiange生物技術(北京)公司。

Safire熒光酶標儀 瑞士Tecan公司;HPLC儀器為Agilent 1100 series 美國安捷倫公司。

1.2 C57/BL6小鼠致敏

C57/BL6小鼠隨機分成兩組，蝦粗提液致敏組和PBS對照組，飼養(yǎng)一周后開始免疫，0.5mg/mL蝦蛋白粗提液與2.5mg/mL Al(OH)3佐劑等體積混勻后，皮下多點注射，0.2mL/只，對照組注射等體積0.01mol/L pH7.4 PBS與Al(OH)3佐劑混合液，每隔一周激發(fā)免疫1次，觀察激發(fā)后過敏癥狀。激發(fā)第三次后一周加強免疫。

1.3 Western Blot分析小鼠血清中的特異性lgE和lgG1抗體

蝦蛋白粗提液先經SDS-PAGE分離，再轉移至PVDF膜上，轉印后將膜分泳道切成細條。5%脫脂奶粉37℃封閉1h;稀釋的蝦致敏小鼠血清37℃孵育2h，PBS對照組小鼠血清設陰性對照;PBST洗滌，加入HRP標記羊抗小鼠 IgE(1∶10000)或 IgG1二抗(1∶2000)37℃孵育 2h;PBST與 PBS洗滌后，HRPDAB底物顯色;蒸餾水終止反應。

1.4 小鼠PMC分離純化

小鼠加強免疫后一天，摘眼球采血處死，分離血清，-20℃儲存?zhèn)溆谩Ｏ蛐∈蟾骨蛔⑸?mL HBSS液，按摩小鼠腹部5min，抽取腹腔液，將其緩慢注入裝有淋巴細胞分離液的離心管中，4℃ 1500r/min離心10min，吸出中間層的細胞，即為肥大細胞。用HBSS液洗兩次，沖洗后的細胞重新懸浮于3mL HBSS液中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 小鼠PMC的計數(shù)及鑒定

懸浮的PMC分別用臺盼藍和甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察活細胞和肥大細胞純度比例，調整各組細胞濃度使其一致。

1.6 誘導小鼠PMC釋放組胺

詳細方法參考肥大細胞的激發(fā)實驗［7］，略作改進。激發(fā)管中分別加入100μL 100μg/mL蝦蛋白粗提液、相對分子量為36ku的蝦原肌球蛋白、相對分子量為21ku或80ku的蝦過敏原組分作為實驗組;100μL 100μg/mL的蟹蛋白粗提液、塵螨蛋白Der f1和BSA等作為陰性對照;激發(fā)管中直接加入100μL HBSS液作為空白對照組(自發(fā)組胺釋放組)和總組胺釋放組。然后，將分離好的PMC 37℃水浴箱中預培養(yǎng)5min后，向各個激發(fā)管中加入100μL的細胞懸液;實驗組、陰性對照組及空白對照組激發(fā)管置于37℃水浴箱中反應 20min，然后加入 150μL冷的HBSS液終止反應，4℃ 2000r/min離心10min后取上清，置4℃?zhèn)溆?總組胺釋放組的激發(fā)管用沸水煮沸2min，冰浴5min后離心后取其上清。相同實驗方案重復5次，每個樣品測定2次取其均值。

1.7 組胺釋放率的測定

1.7.1 熒光酶標儀測組胺定向釋放率 100μL的樣品(即實驗所得上清)加到含150μL三蒸水的96孔熒光酶標板中，依次加入50μL 0.4mol/L NaOH和10μL OPT，避光反應 10min，加入 50μL 0.1mol/L HCl終止反應，然后用熒光酶標儀于吸收光349nm和發(fā)射光448nm測定熒光(IU)值。同時用系列稀釋的組胺標準品制定標準曲線，據(jù)此，計算各樣品組胺的釋放量，組胺的釋放率依據(jù)以下公式獲得:

組胺的釋放率(%)=［(定向組胺釋放量-自發(fā)組胺釋放量)/總組胺釋放量］×100。

1.7.2 HPLC測組胺定向釋放率 HPLC測定樣品組胺定向釋放量，測定的色譜條件為:zorboxSB-C18反相色譜柱，4.6mm×150mm，粒徑5μm;流動相為甲醇-pH4.5醋酸鈉溶液(45∶55)，流速 1.0mL/min;反應液為0.1%OPT的甲醇溶液;熒光檢測器波長:激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長444nm。每份樣品平行測定兩次，以色譜保留時間作為組胺定性分析依據(jù)，樣品組胺出峰面積做定量分析，用系列稀釋的組胺標準品的制定標準曲線計算組胺釋放率。

定向釋放率(%)=(定向組胺釋放量-空白對照組胺釋放量)/總組胺釋放量×100。

1.8 統(tǒng)計學分析

全部結果均采用SPSS(13.0版)軟件分析。組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，p＜0.01具有極顯著性差異;p＜0.05具有顯著差異，p＞0.05無差異。

2 結果與分析

2.1 致敏小鼠過敏癥狀分析

第二次免疫激發(fā)后，致敏C57/BL6小鼠出現(xiàn)明顯過敏癥狀，前爪頻繁捎撓口鼻處，體毛直立，身體顫抖，呼吸頻率加快，精神萎靡，活動減少;對照組無過敏癥狀，說明C57/BL6小鼠成功致敏。

2.2 Western Blot分析致敏C57/BL6小鼠血清中的特異性lgE和IgG1抗體

Western blot分析致敏C57/BL6小鼠血清特異性IgE和IgG1抗體，免疫PBS的小鼠血清作陰性對照，結果分別見圖1A和1B。結果顯示，57.1%(4/7)的致敏小鼠血清IgE和74.1%(5/7)的血清IgG1能特異性識別分子質量為36ku的原肌球蛋白;42.9%(3/7)的小鼠血清IgE和28.6%(2/7)的血清IgG1能識別21ku的過敏原組分;42.9%(3/7)的血清IgE和血清IgG1能識別80ku的過敏原組分。結果表明，36ku的原肌球蛋白是C57/BL6小鼠的主要過敏原，21ku和80ku的過敏原組分是次要過敏原，且它們不僅能引起IgE介導的速發(fā)型過敏反應，還可以引起IgG介導的過敏反應。

圖1 C57/BL6小鼠血清IgE和IgG1與蝦蛋白粗提液的Western blot圖Fig.1 Western Blot of sera IgE and IgG1 from C57/Bl6 mice to shrimp extract

2.3 小鼠PMC計數(shù)及活性鑒定

臺盼藍和甲苯胺藍染色后分別鏡下計數(shù)觀察:能被被臺盼藍染成藍色的為死細胞，其余為活細胞;能被甲苯胺藍染成紫紅色的細胞為肥大細胞。結果顯示，總細胞細胞密度為1.2×106個/mL，其中活細胞占總細胞的95%，肥大細胞占活細胞數(shù)的90%以上。

2.4 PMC組胺定向釋放率的測定

2.4.1 熒光酶標儀法測定組胺定向釋放率 熒光酶標儀法測定各組致敏小鼠PMC組胺定向釋放率結果(如圖2)顯示，蝦蛋白粗提液、21ku蛋白、36ku蛋白及80ku蛋白等實驗組與空白對照組間均有極顯著差異(p＜0.01，n＞5)，陰性對照組中的蟹蛋白粗提液組與空白對照相比具有顯著差異(p＜0.05，n＞5)，其它陰性對照組與空白組相比均無顯著差異。蝦過敏組分中，36ku原肌球蛋白誘導的組胺釋放率最高，為21.59%，80ku和21ku蛋白次之，分別為11.29%和14.39%，這與文獻報道的原肌球蛋白是蝦的主要過敏原相一致。與空白對照組相比，蟹蛋白粗提液誘導的組胺釋放率也具有顯著性差異(p＜0.05)，表明蟹蛋白粗提液中具有與蝦過敏原相似或相同過敏原表位的蛋白，這與文獻報道的蝦、蟹過敏原間存在交叉反應相一致;Der f1蛋白組與BSA組與空白對照組無顯著差異，說明塵螨過敏原及牛奶過敏原都與蝦過敏原間不存在交叉反應。

2.4.2 HPLC法測定組胺定向釋放率 HPLC法測定系列濃度組胺建立的標準曲線見圖3A，測得并計算的各組致敏小鼠PMC組胺定向釋放率的結果見圖3B。結果顯示，與空白對照組相比，蝦粗提液、21ku蛋白、36ku蛋白及80ku蛋白等實驗組均有極顯著差異(p＜0.01，n＞5);陰性對照組中的蟹蛋白粗提液組與空白對照相比具有顯著差異(p＜0.05，n＞5)，其它陰性對照組與空白組相比均無顯著差異。HPLC測定的組胺釋放率的結果與熒光酶標儀法測定的結果無顯著差異，且定向誘導PMC釋放組胺的釋放率高低的過敏原是一致的。結果表明熒光酶標儀法和HPLC都可以用于組胺含量的測定。

圖2 熒光酶標儀測定PMC組胺定向釋放率Fig.2 Detecting of histamine release ration from peritoneal mast cell by Fluorescence microplate reader

圖3 HPLC測PMC組胺定向釋放率Fig.3 Detecting of histamine release ration from peritoneal mast cell by HPLC

3 討論

目前，運用動物模型和細胞模型評價、預測食物的致敏性是國際上研究和開發(fā)的熱點領域［8］。文獻報道的過敏動物模型有:C3H/HeJ小鼠、Balb/C小鼠、C57/BL6 小鼠、BN 大鼠、豚鼠及幼豬、狗等［6，8-9］。不同品系的動物對不同食物過敏原的敏感性和特異性存在差異［9］，因此研究實驗動物對食物過敏原免疫應答的敏感性和特異性及其與人類過敏的異同，即需選擇合適品系的動物建立評價和檢驗不同過敏食物或過敏原的動物模型。

本研究運用蝦蛋白粗提液致敏C57/BL6小鼠，采用過敏相關抗體-血清IgE和IgG1來評價分析C57/BL6小鼠與人類對蝦中不同過敏原組分產生過敏反應的異同。結果顯示，相對分子量為36ku的蝦原肌球蛋白C57/BL6的主要致敏原，相對分子量為21ku和80ku的蛋白是C57/BL6的次要過敏原，這與文獻報道［10-11］蝦原肌球蛋白是人類的主要蝦過敏原，21ku和80ku蛋白為人類蝦次要過敏原相一致;此外，蟹蛋白粗提液能定向誘導蝦致敏小鼠PMC定向釋放組胺，與文獻報道［12］的蝦、蟹過敏原間具有交叉反應相一致，表明人類與C57/BL6小鼠對蝦中不同過敏原組分的敏感性具有高度的相似性。因此，C57/BL6小鼠是評價和檢測蝦過敏原的良好動物模型，同時也可能是研究人類的蝦過敏機制甚至復雜食物過敏機制的有效動物模型。

另外，本文通過運用蝦不同過敏原組分體外定向誘導蝦致敏小鼠PMC釋放組胺釋放率的差異，分析蝦不同過敏原的致敏差異的結果顯示，36ku原肌球蛋白誘導的組胺釋放率最高，其次是80ku和21ku蛋白，這與致敏小鼠血清IgE和IgG1等過敏相關抗體的檢測結果一致，表明體外檢測組胺釋放的方法可以作為評判過敏原致敏性的有效方法，為建立更加簡便、快速的過敏原檢測方法提供了方向。然而，同一物種不同個體對過敏原的致敏性存在差異，不同物種間差異性更大，因此用單一小鼠模型和致敏的小鼠肥大細胞模型來評價食物過敏原具有一定的局限性。因此，我們下一步將探討各種不同過敏食物的最佳動物模型，同時構建表達人IgE高親力受體FcεRI的工程細胞株［13-14］或者直接用人的肥大細胞株作為細胞模型分析不同過敏原的致敏性差異，建立研究食物過敏機制和食物過敏原檢測的新模型。

［1］曹軍皓，閻有功.食物過敏的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2011，17(3):1985-1987.

［2］Codex Alimentarius commission.CODEX STAN 1-1985(Rev.1-1991)General standard for the Labeling of Prepackaged Foods［S/OL］.htttp://www.Codexalimentarius.net/web/index_en.jsp，2010-08-31.

［3］謝力，相大鵬，韋曉群，等.主要貿易國和地區(qū)食品中致敏原標識措施比較及其對我國的啟示［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2011，5(23):449-452.

［4］黃峙，郭寶江.食品過敏原檢測與評價技術研究進展［J］.食品科學，2003，23(8):240-244.

［5］李志君 .食品過敏研究進展［J］.職業(yè)與健康，2006，22(13):968-970.

［6］Ladics GS，Knippels LMJ，Penninks AH，et al.Review of animal models designed to predict the potential allergenicity of novel proteins in genetically modified crops［J］.Regul Toxicol Pharm，2009，56(2):212-224.

［7］劉婉瑩，向軍儉，蔣紅玲，等.肥大細胞鉆體外釋放模型在食品過敏原分析中的應用［J］.食品科學，2008，29(8):576-578.

［8］孫拿拿，彭于發(fā)，賈旭東，等.轉基因食品致敏性評價嚙齒類動物模型研究進展［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2009，21(5):473-477.

［9］DearmanRJ，KimberR I.Animalmodelsofprotein allergenicity:potential benefits，pitfalls and challenges［J］.Clin Exp Allergy，2009，39(4):458-468.

［10］Sanchez G，Gamez C，Lopez E，et al.Allergy to shrimp:A double blind，Placebo-controlled，food challenge study and allergens implicated in Spain［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，123(2):S23.

［11］黃建芳，林婷婷，向軍儉，等.河蝦主要過敏組分的分離、純化、鑒定及其致敏性分析［J］.細胞與分子免疫學雜志，2010，26(5):444-447.

［12］王彩霞，黃建芳，向軍儉，等.蝦、蟹交叉過敏原的研究［J］.免疫學雜志，2012，28(5):416-419.

［13］Vogel L，Ttkopf D，Hatahet L，et al.Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system［J］.Allergy，2005，60(8):1021-1028.

［14］Kaul S，Luttkopf D，Kastner B，et al.Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergens standardization［J］.Clin Exp Allergy，2007，37(1):141-150.