致乳糜瀉小麥麩質(zhì)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

朱曉燕，袁娟麗，陳紅兵，高金燕

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西南昌330047;4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047)

小麥?zhǔn)鞘澜缟弦环N主要的經(jīng)濟(jì)作物，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在日常飲食中深受人們的喜愛(ài)。但同時(shí)，小麥也是一種嚴(yán)重的食物過(guò)敏原，可以引發(fā)多種過(guò)敏性疾病，如哮喘、運(yùn)動(dòng)激發(fā)過(guò)敏癥、蕁麻疹以及乳糜瀉等［1-2］。其中，乳糜瀉是遺傳易感者因攝入麩質(zhì)(主要是小麥及其相似谷物的儲(chǔ)藏蛋白)而引發(fā)的慢性小腸炎癥疾病。該病過(guò)去被認(rèn)為是種少見(jiàn)病，且有地域差異，以歐洲，尤其北歐多見(jiàn)，在西方國(guó)家的發(fā)病率為0.5%～2%［3-5］，我國(guó)近年來(lái)也報(bào)道了多例乳糜瀉病例［6-7］。由于人們對(duì)乳糜瀉認(rèn)識(shí)的不夠，許多患者可能會(huì)被誤診為普通腸道疾病。但近年來(lái)隨著對(duì)該病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的提高和診斷措施的不斷完善，發(fā)現(xiàn)乳糜瀉的患病率較以前明顯增高，且在亞洲國(guó)家的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)［8］。乳糜瀉臨床特征主要是腸粘膜絨毛萎縮，從而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)吸收不良、腹瀉、生長(zhǎng)遲緩、貧血、骨質(zhì)疏松等。目前，無(wú)麩質(zhì)飲食是乳糜瀉唯一可靠的治療方式。我國(guó)是小麥消費(fèi)大國(guó)，小麥?zhǔn)称吩谌粘Ｉ钪邪缪葜匾慕巧５@對(duì)乳糜瀉患者卻是一個(gè)極大的威脅，因?yàn)闃O少量的麩質(zhì)就會(huì)導(dǎo)致患病，這將嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而且由于食物配料的多樣化，食物的組成變得十分復(fù)雜，除了食品組分中標(biāo)出的人為加入的麩質(zhì)成分外，食品中其它組分以及各種食品在公用設(shè)備使用過(guò)程中產(chǎn)生的交叉污染都有可能給乳糜瀉患者帶來(lái)危害。因此，小麥、小麥類(lèi)制品及其它食物中致乳糜瀉小麥麩質(zhì)的檢測(cè)顯得尤為重要。

1 小麥中致乳糜瀉蛋白

小麥麩質(zhì)(gluten)已明確為小麥中致乳糜瀉的蛋白，主要包括麥醇溶蛋白(gliadins)和麥谷蛋白(glutenins)，二者大約占小麥仁儲(chǔ)藏蛋白的80%，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸殘基［9］。其中，半胱氨酸殘基對(duì)面團(tuán)的形成和功能起著重要作用，它主要在蛋白間形成分子間二硫鍵，產(chǎn)生蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而對(duì)面團(tuán)的粘彈性產(chǎn)生重要的影響。

麥醇溶蛋白為單肽鏈，分子量較小，為 30～75ku［10］，通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵、氫鍵和疏水作用形成球狀結(jié)構(gòu)(如圖1)，無(wú)分子間二硫鍵，它賦予面筋延展性，是影響小麥面筋烘烤品質(zhì)的重要因素，主要包含α/β-、γ-、ω-型［11］。其中 α/β-、γ-型醇溶蛋白分子量在30～45ku之間，富含半胱氨酸;ω型醇溶蛋白分子量在45～75ku之間，但半胱氨酸含量較低［12］。

麥谷蛋白(如圖1)則是一類(lèi)非均質(zhì)的大分子聚合體，包含高分子量蛋白亞基(HMW:80～130ku)和低分子量蛋白亞基(LMW:10～70ku)［9］。其中 HMW亞基又可分為x型和y型亞基，LMW亞基可分為B-，C-和D-型亞基［13］。麥谷蛋白的氨基酸組成多為極性氨基酸，容易發(fā)生聚集作用，主要賦予面團(tuán)彈性并決定面團(tuán)的強(qiáng)度。

圖1 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白［14］Fig.1 Schematic image of gliadins and glutenins

小麥麩質(zhì)是乳糜瀉發(fā)生的必要條件，研究發(fā)現(xiàn)在麩質(zhì)蛋白上存在許多特異性T細(xì)胞刺激性表位，特別是 α/β、γ-醇溶蛋白，HMW-和 LMW-麥谷蛋白上也存在這些表位［15］。這些特定的表位肽段在腸道粘膜固有層被抗原遞呈細(xì)胞表面的HLA-DQ2(或HLA-DQ8)受體識(shí)別，然后被呈遞給CD4+T細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致發(fā)病［16］。另外，麩質(zhì)蛋白富含脯氨酸，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性使得麩質(zhì)蛋白不容易被胃腸道消化酶完全降解，而生成一些較大的肽段(如長(zhǎng)度為33個(gè)堿基的肽段)。這些麩質(zhì)蛋白免疫顯性肽可能在腸道內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在，加大了觸發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)率。

2 小麥麩質(zhì)檢測(cè)方法

目前乳糜瀉尚無(wú)特效療法，所以患者嚴(yán)格避免食用含有麩質(zhì)成分的食物是最佳選擇。然而，小麥消費(fèi)已經(jīng)遍布世界各地，已躋身于三大消費(fèi)谷物之一。除了制作烘焙食品和意大利面外，麩質(zhì)還被當(dāng)做食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，且麩質(zhì)也被用來(lái)制造個(gè)人護(hù)理用品、營(yíng)養(yǎng)品和藥品。另外，傳統(tǒng)的無(wú)麩質(zhì)產(chǎn)品和不含小麥的產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工以及包裝過(guò)程中，還可能受到交叉污染。顯而易見(jiàn)，谷物及谷物片段在食品加工行業(yè)中無(wú)處不在。此外，最近一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)腹腔能夠承受的麩質(zhì)水平是攝入量每天不超過(guò)50mg的麩質(zhì)蛋白［17］，但目前麩質(zhì)的最低激發(fā)劑量未見(jiàn)報(bào)道［18］。食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission，CAC)規(guī)定無(wú)麩質(zhì)食品的麩質(zhì)含量不超過(guò)20mg/kg［19］。由此可見(jiàn)，食品中麩質(zhì)含量的準(zhǔn)確檢測(cè)，以及無(wú)麩質(zhì)食品標(biāo)簽的制定，對(duì)于乳糜瀉患者的健康和安全飲食極為重要。迄今為止，用于麩質(zhì)含量檢測(cè)的方法主要包括ELISA法，免疫印跡法，質(zhì)譜法，以及PCR法。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

目前，市場(chǎng)上用于麩質(zhì)定性和定量的方法主要是ELISA法，該法靈敏性高、特異性強(qiáng)、快速、費(fèi)用低。用于檢測(cè)麩質(zhì)的ELISA商業(yè)試劑盒有多種，這些試劑盒主要采用雙抗夾心法，檢出限范圍為2～10mg/kg［20］。但大多數(shù)試劑盒主要是基于 Skerritt抗體［21］和 R5 抗體［22］。Skerritt抗體主要是針對(duì)ω-醇溶蛋白，R5抗體則針對(duì)廣泛存在于 α/β-、γ-、ω-醇溶蛋白上的表位，包括 QQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFP等。有研究表明，Skerritt抗體對(duì)麥谷蛋白的親和力較麥醇溶蛋白高［20，22］，R5 抗體對(duì)麥醇溶蛋白的親和力較麥谷蛋白要高［22-23］。但很遺憾，這種親和力差異對(duì)麩質(zhì)定量的影響在商業(yè)檢測(cè)試劑盒中尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前，食品法典委員會(huì)(CAC)認(rèn)可的檢測(cè)麩質(zhì)含量的方法是基于R5抗體的夾心ELISA法［24］。該法既可以檢測(cè)天然的麩質(zhì)蛋白也可以檢測(cè)加工過(guò)的麩質(zhì)蛋白。但夾心ELISA法也具有局限性，它在檢測(cè)過(guò)程中需要待檢抗原含有兩個(gè)或兩個(gè)以上可被R5單抗識(shí)別的表位。通常，對(duì)于許多水解食物，在加工過(guò)程中，蛋白被打斷成碎片，最后可能只剩下一個(gè)毒性表位，在這種情況下，麩質(zhì)蛋白仍能導(dǎo)致乳糜瀉的發(fā)生，但卻不易被檢測(cè)出。2011年，應(yīng)食品法典委員會(huì)的要求，Mena等［25］開(kāi)發(fā)出了基于R5抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA，該法可以很好的解決上述問(wèn)題，其檢出限和定量限分別為0.72mg/kg和2.44mg/kg的麥醇溶蛋白。

當(dāng)然，除了商業(yè)試劑盒外，還有許多實(shí)驗(yàn)室的方法用于檢測(cè)麩質(zhì)［26-28］。這些方法主要是麩質(zhì)蛋白的提取方法和使用的抗體不同，如 Morón等［26］采用基于 33個(gè)堿基肽(LQLQPFPQPQLPYPQPQLP YPQPQLPYPQPQPF)的單抗進(jìn)行夾心和競(jìng)爭(zhēng)ELISA，其檢出限分別為1mg/kg和0.5mg/kg的麥醇溶蛋白。秦倩茹等［28］建立了檢測(cè)小麥醇溶蛋白的定量夾心ELISA法，采用的抗體為兔抗醇溶蛋白抗體，定量檢出限為7.81mg/kg。此外，還有基于α-、γ-醇溶蛋白肽的單抗和PN3(LGQQQPFPPQQPYPQPQPF)單抗等等，但這些方法均沒(méi)有得到食品法典委員會(huì)的認(rèn)可。

迄今為止，現(xiàn)有的檢測(cè)麩質(zhì)的ELISA方法仍存在缺陷。主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:a.重復(fù)性不夠高:ELISA法容易受到板包被、加樣、洗板、反應(yīng)溫度和時(shí)間等許多因素影響，因而造成重復(fù)性差;b.易受抗體的影響:由于各種抗體的特異性不同，其檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，甚至出現(xiàn)交叉反應(yīng);c.檢測(cè)對(duì)象的局限性:目前ELISA商業(yè)試劑盒使用的R5抗體和Skerritt抗體檢測(cè)的都是麥醇溶蛋白，而引發(fā)乳糜瀉的T細(xì)胞表位不僅存在于麥醇溶蛋白上，麥谷蛋白上也含有。理論而言，這兩種單抗用于檢測(cè)致乳糜瀉毒性麩質(zhì)的準(zhǔn)確性不如抗T細(xì)胞表位的抗體，但這種差異目前并沒(méi)有得到很好的比較研究。

ELISA方法使用的抗體比較關(guān)鍵，其結(jié)果的準(zhǔn)確性關(guān)系到乳糜瀉患者的安全健康飲食。現(xiàn)存的各種檢測(cè)抗體，包括食品法典委員會(huì)認(rèn)可的R5單抗，都存在著許多爭(zhēng)議。目前，并沒(méi)有統(tǒng)一的用于檢測(cè)麩質(zhì)的抗體，因此，急需開(kāi)發(fā)出一種能夠準(zhǔn)確定量出致乳糜瀉毒性麩質(zhì)的抗體。

2.2 免疫印跡法

根據(jù)定量免疫印跡的原理，也可以檢測(cè)出產(chǎn)品中麩質(zhì)的含量［29-30］。該法主要是結(jié)合SDS-PAGE電泳和免疫印跡。在后期的印跡過(guò)程中，也是采用基于麩質(zhì)的各種特異性抗體。如，Van den Broeck等［30］人開(kāi)發(fā)出了基于T細(xì)胞表位的單克隆抗體Glia-α9和Glia-α20，并應(yīng)用于免疫印跡檢測(cè)毒性表位。

由于免疫印跡技術(shù)的局限性，如在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印的好壞受多種因素的影響，且需根據(jù)印跡的強(qiáng)弱來(lái)確定麩質(zhì)的量。因此，該法在麩質(zhì)蛋白定量的精確性上還有待提高。目前，該法在篩查低致乳糜瀉毒性小麥及其他低乳糜瀉毒性谷物品種方面的應(yīng)用比較多。采用此法，可以較直觀地比較出各品種麩質(zhì)蛋白的種類(lèi)與含量的差異，也可通過(guò)印跡的結(jié)果鑒定各單抗的特異性程度。

2.3 質(zhì)譜法

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)是第一個(gè)使用非免疫技術(shù)來(lái)檢測(cè)面粉和食物樣本中麩質(zhì)含量的方法［31］，可以檢測(cè)面粉、淀粉類(lèi)食物中的小麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、黑麥醇溶蛋白以及燕麥谷蛋白。與其它方法相比，該法同樣需要樣品前處理，但在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中不需要使用抗體，而是直接根據(jù)質(zhì)譜模式圖定量出醇溶蛋白(25～40ku)。該法對(duì)于加工或非加工的麥類(lèi)食品都適用，其檢測(cè)線性范圍 4～100mg/kg［31］。但是，MALDI-TOF-MS 法不能很好的檢測(cè)出非致乳糜瀉毒性谷物玉米、大米中含有的麥醇溶蛋白，因?yàn)榇竺住⒂衩妆旧砗写罅康拇既艿鞍祝瑫?huì)干擾麥醇溶蛋白質(zhì)譜信號(hào)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Hernando等［32］開(kāi)發(fā)出了兩步法提取出小麥醇溶蛋白，并結(jié)合MALDI-TOF-MS法檢測(cè)以玉米、大米為基質(zhì)的食品中麥醇溶蛋白的含量(30～45ku)，該法的檢測(cè)線性范圍為100～400mg/kg。

由于質(zhì)譜法用于檢測(cè)麩質(zhì)含量低于20～25mg/kg的樣本時(shí)，效果不好，因而不適用于低麩質(zhì)水平的食物樣本的檢測(cè)。為了克服MS檢測(cè)麩質(zhì)的缺陷，Sealey-Voyksner等［33］建立了一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)的方法。液質(zhì)聯(lián)用法是一種高效的分析技術(shù)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，可以從復(fù)雜的食物基質(zhì)中檢測(cè)出目標(biāo)蛋白，在谷類(lèi)蛋白研究方面得到了很好的應(yīng)用。該法主要對(duì)各種常見(jiàn)市售麩質(zhì)類(lèi)食品和無(wú)麩質(zhì)食品中與麩質(zhì)密切相關(guān)的六個(gè)致敏肽(LQPQNPSQQQPQEQVPL、 TQQPQQPFPQQPQQPFPQ、VPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPL、RPQQPYPQPQPQY、QPQQPFPQTQQPQQPFPQ和PQQSPF)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)線性范圍為0.01～100mg/kg，檢出限和定量限分別為1～30μg/kg和10～100μg/kg。液質(zhì)聯(lián)用相比于單一的質(zhì)譜法，對(duì)于低麩質(zhì)含量的食品檢測(cè)具有較好的效果。

質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行、質(zhì)量精度高且結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛運(yùn)用于化學(xué)、化工、醫(yī)藥、材料、生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。但是，與免疫學(xué)檢測(cè)方法相比，質(zhì)譜法依賴貴重設(shè)備，費(fèi)用較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于食品行業(yè)的現(xiàn)場(chǎng)快速、大量檢測(cè)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜法有望突破這些障礙，而廣泛的運(yùn)用于食品行業(yè)麩質(zhì)蛋白的檢測(cè)中。

2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR法)

繼質(zhì)譜法后，又出現(xiàn)了另一種非免疫學(xué)方法—PCR法，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)麩質(zhì)蛋白的基因［34-35］。這種方法主要是通過(guò)體外擴(kuò)增食品中的目標(biāo)DNA序列，然后確定其是否含有麩質(zhì)蛋白。

Debnath等［34］開(kāi)發(fā)出的PCR法主要用于定性檢測(cè)麥谷蛋白，通過(guò)基因擴(kuò)增，獲得麥谷蛋白135bp基因片段的PCR產(chǎn)物，陽(yáng)性樣品通過(guò)擴(kuò)增可以呈現(xiàn)135bp的基因片段。該法的檢出限為21.5pg DNA。而柯燕娜等［35］建立了一種常規(guī)PCR法，用于檢測(cè)各種原料和加工食品中的小麥麩質(zhì)。該法針對(duì)小麥的ω-醇溶蛋白設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增片段大小為185bp的引物，檢出限為10ng。但是，常規(guī)PCR法的缺陷是不能定量出麩質(zhì)含量，而且它檢測(cè)的只是單一的麥谷蛋白或麥醇溶蛋白的DNA，具有很大的局限性。

值得欣慰的是，隨著熒光定量PCR(Q-PCR)的介入，該方法被成功地應(yīng)用于檢測(cè)食品中小麥麩質(zhì)的DNA含量。Mujico等［36］開(kāi)發(fā)出了一種Q-PCR系統(tǒng)用于檢測(cè)小麥麩質(zhì)蛋白的DNA，其定量限為20pg DNA，并將此法與R5 ELISA法進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了水解和深加工的食品外，對(duì)于其它食品，不僅麩質(zhì)含量高于1.5mg/kg(R5 ELISA試劑盒定量限)的食物樣本，而且麩質(zhì)含量低于1.5mg/kg的食物樣本，Q-PCR都可以檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，表明其敏感性優(yōu)于R5 ELISA法，是檢測(cè)食品中是否存在麩質(zhì)的一種有效的非免疫學(xué)方法。

無(wú)論是常規(guī)PCR還是Q-PCR，其在檢測(cè)食物基質(zhì)復(fù)雜、麩質(zhì)含量低的食品上都具有優(yōu)勢(shì)。但是麩質(zhì)成分復(fù)雜，表達(dá)該蛋白的基因也相應(yīng)多種多樣，以上兩種方法每次只能檢測(cè)某單一蛋白的DNA，且引物的設(shè)計(jì)和選擇比較關(guān)鍵，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性擴(kuò)增。同時(shí)，即使是Q-PCR也只能定量出DNA的含量，并不能直接獲得食物中麩質(zhì)蛋白的準(zhǔn)確含量。

3 結(jié)語(yǔ)

乳糜瀉是一種與小麥消費(fèi)密切相關(guān)的食物過(guò)敏疾病，其發(fā)病率隨著小麥消費(fèi)量的增加呈上升趨勢(shì)。麩質(zhì)蛋白的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)于低麩質(zhì)和無(wú)麩質(zhì)產(chǎn)品標(biāo)簽的制定至關(guān)重要。同時(shí)，也與食品安全控制、標(biāo)示、安全預(yù)警等密切相關(guān)。各種檢測(cè)麩質(zhì)蛋白的技術(shù)除可以保障乳糜瀉患者安全消費(fèi)外，還可運(yùn)用于其它食物過(guò)敏原的檢測(cè)，是保障食品安全的支撐技術(shù)。現(xiàn)有的各種檢測(cè)技術(shù)還存在許多缺陷，隨著對(duì)乳糜瀉發(fā)病機(jī)制以及麩質(zhì)蛋白更進(jìn)一步的了解，更為準(zhǔn)確、安全、經(jīng)濟(jì)、快速、適用性廣、高靈敏性的檢測(cè)技術(shù)將會(huì)應(yīng)運(yùn)而生。

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