食物過敏原標準物質(zhì)的研究進展

周 煌，楊安樹，佟 平，袁角建，陳紅兵，高金燕

(1.南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330047)

隨著社會的發(fā)展、人們飲食習慣及食物構(gòu)成的改變，食物過敏已逐漸成為影響部分人群生活質(zhì)量和身體健康的一大隱患。食物過敏又稱食物不良反應，是人體對某些食物產(chǎn)生的變態(tài)反應［1］，可出現(xiàn)多種臨床病癥，嚴重的會引發(fā)過敏性休克甚至死亡。據(jù)相關的流行病學研究表明，食物過敏約影響5%的兒童及3%～4%的成年人的健康，且呈增長趨勢［2］。另外，90%的過敏反應由蛋、魚、貝類、奶、花生、大豆、堅果和小麥等8類高致敏性食物引起［3］。因此，為了有效地預防和控制食物過敏給人類健康帶來的危害，食物過敏原的檢測、診斷以及治療已成為國內(nèi)外研究的熱點。毫無疑問，這些研究工作對食物過敏原標準物質(zhì)的研制提出了新要求［4］。標準物質(zhì)(Reference Material，“RM”)是指已確定其一種或幾種特性，用于校準測量器具、評價測量方法或確定材料特性量值的物質(zhì)［5］。目前，依照各國際組織和國家實際分類的特點，可將標準物質(zhì)歸納成三種主要的分類方法:按特性量值學科分類、按標準物質(zhì)應用領域分類、按標準物質(zhì)物理形態(tài)分類。在我國，按標準物質(zhì)的應用領域?qū)⑵浞譃?3類，包括鋼鐵、有色金屬及金屬中氣體、建材、核材料、高分子材料、化工產(chǎn)品、地質(zhì)礦產(chǎn)、環(huán)境化學、臨床化學與藥品、食品、煤炭和石油、工程和物理［6］。其中，食品也是其中的一大類。

表1 CREATE項目候選標準物質(zhì)理化性質(zhì)分析的參數(shù)和所選擇的分析方法［22］Table 1 Parameters and selected analytical methods for the physico-chemical characterization of Candidate Reference Materials in the CREATE project［22］

1 食物過敏原標準物質(zhì)的制備

標準物質(zhì)是一種實物標準，其種類繁多、應用廣泛，在制備過程中，應當選擇合適的程序、工藝以及防止污染［7］。根據(jù)國家標準物質(zhì)管理委員會規(guī)定，我國一級標準物質(zhì)研制的全過程包括候選物的選擇、標準物質(zhì)的制備、標準物質(zhì)均勻性的檢驗、標準物質(zhì)穩(wěn)定性的檢驗、標準物質(zhì)的定值、標準值的確定及總不確定度的估計、定值結(jié)果的表示和標準物質(zhì)的包裝與貯存，該技術(shù)規(guī)范適用于化學成分、物理化學特性及工程技術(shù)特性一級標準物質(zhì)的研制(二級標準物質(zhì)的研制可參照一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行)［8］。然而，與此不同的是，食物過敏原能夠引發(fā)人體的過敏反應，故在通過一定的實驗方法得到高純度的致敏性蛋白后，在標準物質(zhì)制備過程中，除理化性質(zhì)外，還應增加對其免疫學性質(zhì)的測定。

1.1 食物中主要致敏性蛋白的分離純化

食物過敏原標準物質(zhì)按照是否含有基體，可分為含基體的標準物質(zhì)和不含基體的純標準物質(zhì)。含有基體的分析標準物質(zhì)，如RM 8415(全雞蛋粉);不含基體的純標準物質(zhì)如針對雞蛋中的某個過敏原蛋白，如溶菌酶。對于不含基體的純標準物質(zhì)，蛋白的純化是前提和基礎。目前，常用的純化方法包括沉淀法、膜分離法、柱層析法和電泳法，而柱層析法包括親和層析、凝膠過濾層析、疏水相互作用層析、離子交換層析和高效液相色譜。此外，由于生物技術(shù)、轉(zhuǎn)基因和基因工程技術(shù)的發(fā)展，食物過敏原重組技術(shù)的研究和發(fā)展也越來越受到人們的關注。迄今為止，人們針對某些致敏性食物中的主要過敏原進行了大量的分離純化研究，尤其是雞蛋、牛奶、花生這三類高致敏性食物。顯而易見，這些研究工作為食物中單一過敏原標準物質(zhì)的制備奠定了基礎。

1.1.1 雞蛋中主要過敏原的分離純化 雞蛋中的主要過敏原包括卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵白蛋白和溶菌酶。其分離純化的主要研究包括佟平等［9］采用DEAE-sepharose Fast Flow陰離子層析法，得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白純度高達97%。Dattaa等［10］采用兩步膜超濾法，分離得到的卵白蛋白純度高達98.7%;Chiang等［11］采用兩步法，先將蛋清液經(jīng)膜超濾，再過親和色譜柱，分離得到溶菌酶，其純度為96%，總回收率為79%，活力為 70400;Vachier 等［12］用Q-sepharose FF強陽離子柱，一步從蛋清中分離出了溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白三種主要過敏原，其純度分別為99%、75%和98%。

1.1.2 牛乳中主要過敏原的分離純化 牛乳中的主要過敏原有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白。對于牛乳中主要過敏原的分離純化，Konrad等［13］采用超濾膜分離的方法，獲得純度為95%的α-乳白蛋白。蔡小虎［14］則采用過兩次離子柱的方法，分離出了β-乳球蛋白，SDS-PAGE鑒定其純度高達99%，得率為 34.46%。此外，Schlatterer等［15］和 Goodall等［16］則先后對β-乳球蛋白進行分離純化，其純度均可達到99%。另外，張艷等［17］對 αs、β-酪蛋白進行分離，得到的αs-酪蛋白與β-酪蛋白純度分別為83.33%、109.53%。

1.1.3 花生中主要過敏原的分離純化 Ara h 1～Ara h 11是花生中已確認的11種引起過敏的蛋白。對于花生致敏性蛋白，近年來，研究人員除了研究其天然過敏原的純化方法外，還進行了基因工程重組的研究。例如，吳序櫟等［18］通過硫酸銨沉淀和兩步凝膠層析，純化得到的花生過敏原Ara h 1，SDS-PAGE鑒定其純度大于90%。張英坤等［19］將花生經(jīng)脫脂、粗提和DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析分離后，得到Ara h 2的純度達90%，得率為21.9%。胡純秋等［20］通過重組，并采用 Glutathione Sepharose 4B親和層析柱進一步純化融合的GST-Ara h 2花生蛋白后，SDS-PAGE顯示其純度約為90%。此外，羅春萍等［21］通過脫脂、浸提、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析分離得到Ara h 6，純度大于95%，得率為22.5%。

1.2 過敏原蛋白標準物質(zhì)理化性質(zhì)的表征

食物中致敏性蛋白理化性質(zhì)的表征可參照歐盟CREATE項目中所采用的方法。在CREATE中，作為候選過敏原標準物質(zhì)，在評價其是否可作為標準物質(zhì)生產(chǎn)前，應對其物理化學性質(zhì)(見表1)和免疫學性質(zhì)進行分析，其中，理化性質(zhì)包括鑒定、純度、均一性以及二級結(jié)構(gòu)。此外，其穩(wěn)定性的評定采用的是英國國家生物標準與控制研究所使用的方法，即:先分析冷凍干燥處理對過敏原活性產(chǎn)生的影響，然后將冷凍干燥處理后的致敏性蛋白進行熱加速降解處理，以觀察其長期的穩(wěn)定性［22］。

1.3 過敏性蛋白候選標準物質(zhì)免疫學性質(zhì)的表征

對引發(fā)食物過敏的過敏原，須檢測特異性IgE與過敏原的結(jié)合能力，其目的是為了得知過敏原的致敏性大小。據(jù)文獻報導，CREATE項目分析過敏原的免疫學性質(zhì)主要使用特異性人血清IgE反應。該方法可通過RAST或斑點印跡直接測定IgE的結(jié)合能力，也可以采用RAST抑制性實驗測定IgE的結(jié)合能力，另外，還可通過嗜堿性粒細胞組胺釋放實驗進一步進行IgE結(jié)合能力的評估［22］。

2 食物過敏原標準物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

相對而言，國外開展食物過敏原標準物質(zhì)的研究起步較早。早在20世紀70年代，世界衛(wèi)生組織和國際免疫學會聯(lián)合會(WHO/IUIS)就認識到過敏原產(chǎn)品標準化的重要性。1981年，該聯(lián)合會建立了一個由學術(shù)機構(gòu)和過敏原制造商資助的項目，旨在生產(chǎn)能夠獲得世界衛(wèi)組織所認可的過敏原提取物，并以此作為國際標準(IS)［22］。近年來，在食物過敏原蛋白標準化方面，國內(nèi)外進行了大量的研究，并組建了有關食物過敏的專門研究機構(gòu)，如美國國家標準與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)。此外，還啟動了一些重大項目，如歐盟資助的EuroPrevallProject和CREATE Project。在我國，針對食物過敏及其標準化的研究，則主要集中在高校和科研機構(gòu)，且剛剛起步。

2.1 國外食物過敏原標準物質(zhì)研究的重要機構(gòu)和重大項目

2.1.1 美國國家標準與技術(shù)研究院(NIST)NIST是美國商務部直屬的一個研究院，成立于1901年，其主要任務之一是提供標準物質(zhì)和標準參考數(shù)據(jù)。迄今為止，NIST提供了1200多種標準物質(zhì)，其中也包括致敏性食物標準物質(zhì)，包括RM 8415(全雞蛋粉)、RM 8435(全牛奶粉)、RM 8418(小麥蛋白粉)、RM 8436(硬質(zhì)小麥粉)、RM 8437(硬紅小麥粉)、RM 8438(軟小麥粉)和 RM 8414(牛肌肉粉)(http://www.nist.gov/index.html)。從用途來看，這些標準物質(zhì)都是用于評價分析方法和校準分析儀器，且主要用于測定其中的主要、次要和微量元素成分，而并非用于校準檢測食物過敏原的ELISA分析方法［23-24］。

到目前為止，RM 8445(全雞蛋粉)是制備出的唯一一個用于食物過敏原檢測的標準物質(zhì)，它是由美國食品藥品管理局(FDA)、食品協(xié)會(FPA)、加拿大衛(wèi)生部、歐盟標準物質(zhì)與測量研究所(IRMM)和美國內(nèi)布拉斯加大學食物過敏研究和資源項目共同生產(chǎn)的一個標準物質(zhì)，該標準物質(zhì)經(jīng)FDA包裝并由NIST發(fā)布。此外，NIST還希望通過這些組織的合作，研制出其它用于過敏原檢測的標準物質(zhì)［25-26］。RM 8445是一種經(jīng)噴霧干燥制成的含多種致敏性蛋白的全雞蛋粉，與雞蛋中的單個主要過敏原標準物質(zhì)相比，RM 8445的優(yōu)點在于更符合食品工業(yè)加工中實際所用的原材料，更具實用性。

2.1.2 EuroPrevall Project EuroPrevall Project是一個歐盟資助的多學科綜合研究項目，始于2005年，該項目包括17個歐洲成員國、67個合作伙伴、15個臨床組織和6個小中小型企業(yè)(SMEs)以及在歐洲先進的過敏研究機構(gòu)，致力于研究“歐洲食物過敏的基本原理和發(fā)病率”(http://www.europrevall.org/)。之后，新西蘭、澳大利亞、俄羅斯、印度和中國也參與了該項目［27］。此外，EuroPrevall還強調(diào)對整個歐洲的食物過敏原進行有效的管理，并研究食物過敏的社會經(jīng)濟學影響［28］。該項目主要研究如何生產(chǎn)及測定高質(zhì)量的食物過敏原，其目的主要是將其用于診斷食物過敏。此外，該項目還研究不同的加工方法對食物致敏性的影響。

通過對大量食物過敏原信息的收集，EuroPrevall建立了一個食物過敏原數(shù)據(jù)庫 http://www.europrevall.org/。迄今為止，自該項目實施后，已從植物或動物性食物來源中純化出了46種食物過敏原，并全面表征了其結(jié)構(gòu)、免疫學性質(zhì)并評估了其致敏性，其中也包含雞蛋、牛奶和花生中的主要過敏原［29］。而在 EuroPrevall數(shù)據(jù)庫建立前，國際上還出現(xiàn)了一些其它過敏原數(shù)據(jù)，例如，過敏原在線(http://www.allergenonline.org/)和國際免疫學會聯(lián)盟(IUIS)過敏原數(shù)據(jù)庫(http://www.allergen.org/)。國際免疫學會聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫為過敏原提供了系統(tǒng)命名法，并由過敏原命名小組委員會授予官方稱謂［30］。這些數(shù)據(jù)庫的建立為廣大食物過敏原及其相關研究的學者提供了有關食物過敏原的相關信息。毫無疑問，在食物過敏原標準物質(zhì)的研究階段，這些數(shù)據(jù)庫所提供的信息將為食物過敏的診斷及食物過敏原的標準化提供有力的支持。

2.1.3 CREATE Project 歐盟資助研究過敏的另外一個重大項目CREATE，始于2001年。該項目成立的目標有兩個:a.生產(chǎn)標準化的天然和重組主要過敏原候選有證標準物質(zhì)，并應達到一定的標準，這些標準包括獲得國際相關組織的認可、過敏原含量已知、具有較高的純度以及良好的理化和免疫學性質(zhì);b.確認夾心ELISA為主要過敏原檢測的方法，并在此基礎上對主要過敏原的含量進行量化［31］。

迄今為止，CREATE項目共研發(fā)了18種過敏原，包括8種天然過敏原和10種重組過敏原。rBet v 1、rPhl p 1、rPhl p 5a 和 rPhl p 5b、rOle e 1、rDer p 1、rDer p 2、rDer f 1和rDer f 2是其代表性的重組過敏原分子。研究表明，通過比較重組過敏原與其天然過敏原的理化和免疫學性質(zhì)，有3個重組過敏原與其對應的天然過敏原有很大的相似性，分別是重組白樺樹花粉過敏原(rBet v 1)、重組梯牧草花粉過敏原(rPhl p 5a)和重組屋塵螨過敏原(rDer p 2)。隨后，歐洲藥品和醫(yī)療質(zhì)量局生物制品標準化計劃BSP090，對GMP條件下生產(chǎn)的rBet v 1進行了一系列理化和生物學性質(zhì)的表征，研究證實，重組過敏原rBet v 1與其對應的天然過敏原具可比性，并進一步證明了rBet v 1可作為Bet v 1的候選標準物質(zhì)［32］。

雖然，CREATE項目所研究的不是食物過敏原，而主要是花粉和屋塵螨等過敏原標準物質(zhì)的制備，但同樣作為致敏性蛋白標準物質(zhì)的研究，其制備方案可為未來天然和重組食物過敏原標準物質(zhì)的研制提供參考。

2.2 國內(nèi)食物過敏原標準物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

我國尚無針對食物過敏原蛋白的標準物質(zhì)，但我國在蛋白質(zhì)標準物質(zhì)的研制方面已積累一些經(jīng)驗，為我國食物過敏原蛋白標準物質(zhì)的研究提供了良好的技術(shù)支撐。例如，中國計量科學院研發(fā)了3個濃度水平的牛血清白蛋白溶液標準物質(zhì)和2個濃度水平的糖基化血紅蛋白標準物質(zhì)。另外，衛(wèi)生部北京醫(yī)院研制出了氰化高鐵血紅蛋白標準物質(zhì)［33］，北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心研制出了金黃地鼠羊瘙癢病理性朊蛋白標準物質(zhì)［34］。此外，我國在食物過敏研究方面，已成立了一些科研團隊，例如，本實驗室在食物過敏方面進行了大量的研究，尤其在雞蛋、牛奶和花生過敏原的分離純化方面取得了顯著的成果。

由此可見，國內(nèi)有關食物過敏的研究相對滯后。我國未來在食物過敏原標準物質(zhì)研究方面的發(fā)展，除應提高自身的科研能力外，還應加強與國際研究機構(gòu)的溝通與協(xié)作。

3 結(jié)語

食物過敏是世界性難題，為了防止消費者誤食過敏性食物，美國、日本和歐盟都都頒布了食物標簽法，要求對食品中的8大類食物過敏原進行標注［35-36］。這一目標的實施需要對過敏原進行檢測，而且依賴標準物質(zhì)準確檢測過敏原的種類和含量。通過以上綜述，可以看出:a.考慮食物復雜基體的影響及食物中某一主要過敏原純化的研究成果，食物中單一過敏原的標準化比對某種致敏性食物的標準化更容易實現(xiàn)，尤其是雞蛋、牛奶和花生這三類致敏性食物;b.重組過敏原為食物過敏原標準物質(zhì)的制備開辟了一條嶄新的途徑。

總之，隨著科學技術(shù)的發(fā)展以及人們探索的不斷深入，食物過敏原標準物質(zhì)的研究將邁向一個新的臺階。

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