曲霉菌細胞工廠的現狀及前景

顧豐穎，高 潔，何國慶

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310058)

曲霉菌(Aspergilli)是一類最為常見的真核微生物，被應用于傳統的食品發酵中也具有悠久的歷史。近年來，隨著生物技術的發展，曲霉菌在食品工業，飼料業，制藥業等方面均顯示出重要的應用價值。與細菌及酵母等相比，曲霉具有強大的降解酶系及完善的蛋白分泌途徑，使其具有可快速生長繁殖，適應惡劣環境，在低值培養基及低pH環境中仍能保持較高的生物代謝活性等特性。此外曲霉菌具有高效分泌系統［1-2］，可將酶或其他多肽高效分泌出體外，有利于重組蛋白的分離純化。由于其可更好的適應工業發酵，曲霉菌逐步被開發為良好的工業生產宿主菌即微生物細胞工廠。目前已被分類并已命名曲霉屬約有250種［3］，其中包括黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)、醬油曲霉(A.sojae)、土曲霉(A.terreus)等許多重要的工業菌種。近年來通過生物技術的介入，曲霉菌已被開發成為多種有機酸(檸檬酸、沒食子酸、葡糖酸等)以及工業酶、蛋白制劑(纖維素酶、淀粉酶、果膠酶等)的主要工業生產菌［4］。

1 曲霉菌基因及基因組

1.1 策略及工具

近十年來隨著對真菌曲霉研究的深入，更多的新方法及技術被應用在對曲霉菌的基因研究中，這些研究主要圍繞在以下幾個方面［5］。第一是建立有效的遺傳轉化體系。缺乏有效的遺傳轉化系統一度成為曲霉菌株工業化基因操作最大的障礙，這不僅限制了選擇性標記的有效性，還降低了基因打靶效率(通常約1%～5%)。近年來，以原生質體介導的多種曲霉(包括黑曲霉，米曲霉，土曲霉，醬油曲霉等)的遺傳轉化系統得以建立［6］;泡盛曲霉的遺傳轉化系統也通過土壤桿菌介導轉化得到有效的解決［7］。此外，已開發的自主復制載體融合了多種選擇性標記系統(如抗生素抗性標記:hph、ble、oliC3;營養缺陷型標記:pyrG、pyrE、argB、adeA、adeB、niaD、trpC、sC;營養標記amdS、ptrA等)，這為曲霉菌株的工業化基因操控提供了更大的可能性［8-10］。曲霉菌分子研究的大躍進基于真菌模式菌株粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的開發，對其研究中發現當受體菌株缺乏非同源末端連接(non-homologous end joining)時，同源重組率可增加到100%。這已在黑曲霉、米曲霉等多個曲霉菌種得到證實。

其次是建立高水平可控的蛋白生產的表達系統。目前應用曲霉菌生產重組蛋白的表達系統已有多個成功案例，二十多種曲霉啟動子被應用于高水平的同源或異源蛋白的生產中［9］。這些啟動子一般是通過結構活性(葡糖淀粉酶啟動子PglaA等)或培養基碳源的誘導作用(乙醇脫氫酶啟動子 PalcA、α-淀粉酶啟動子PamyA等)而產生效應的。此外建立高通量基因定向工具，以及建立細胞生物技術研究的影像播放技術也是曲霉菌基因研究的主要方向。

1.2 曲霉菌的基因組學

1998年，Cereon公司對構巢曲霉(A.nidulans FGSC A4)的基因組進行測序從而開啟了曲霉菌基因組測序的先河，該全基因組采用鳥槍法測序，3倍覆蓋率，然而該序列的信息在近年來才被公開。隨后，構巢曲霉的全基因組進一步采用了13倍覆蓋率進行測序，并在2003年被Whitehead機構/MIT基因組研究中心(也就是現在的Broad機構)公開，其全基因大小約30.1M堿基對，包含了8個染色體組［11］。隨后，真菌特別是曲霉菌的基因組得到快速的發展(表1)，例如韋爾科姆基金會桑格研究院(Wellcome Trust Sanger institute)以及基因組研究學會(TIGR)共同進行的煙曲霉(A.fumigatus Af293)基因組測序，采用全基因組隨機測序方法結合光學標測法(optical mapping)獲得包括8個染色體組的29.4M堿基對的序列數據［12］。而三株不同的黑曲霉工業菌株的基因組也先后被三家機構測序(即荷蘭的帝斯曼公司DSM、美國Integrated Genomics公司及美國能源部基因組學研究所JGI)。2001年底DSM首先采用BAC和鳥槍法完成了黑曲霉CBS 513.88的測序，大小33.9Mb，8倍覆蓋率14000多個基因，但該數據一直到2007年前一直為其公司內部使用［13］。隨后，黑曲霉ATCC 9029菌株被Integrated Genomics公司測序，大小約32Mb，4倍覆蓋率，約10000個重疊群。與此同時在美國能源部的支持下JGI完成了黑曲霉ATCC 1015菌株的基因組測序，獲得約34.9Mb的序列信息，8.9倍覆蓋率并于2006年公開發表［14］。此外，對米曲霉(A.oryzae)的測序由日本的工業科學技術進展國際學會(AIST)進行。米曲霉RIB40的全基因組于2005年公開發表，基因組大小約37.2Mb，9倍覆蓋率，包括8個染色體組［15］。到目前，曲霉菌的基因組測序已完成了十余個，表2為已公開發表的曲霉基因組序列的公共網址。

表1 曲霉菌基因組的簡要信息Table 1 Summary of information on Aspergillus genomes

曲霉基因組數據的公開，使建立在基因組基礎上的轉錄組，蛋白質組及代謝組等方面的研究得到快速的發展。所獲得的大量基礎數據為建立曲霉菌細胞工廠奠定了基礎，也為工業生產菌株的性能改造提供了更多的思路以及更大的可能性。

2 后基因組時代曲霉菌組學技術的發展

真菌基因組測序的大規模完成使曲霉菌的研究進入了系統生物學的時代。為挖掘探討并更好地利用所獲得的大量數據，一些新技術新方法也應運而生，從而產生了真菌生物學研究的一個全新技術——組學技術(Omics)。對全基因、全蛋白以及代謝調控網絡整體的研究取代了過去對單個基因單個蛋白的研究，這使對曲霉工業菌株在生產性能，穩定性能及可行性上的分析更為深刻。組學技術可分支為轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、反應組學及表達組學等，這些全新的技術及方法為構建曲霉菌細胞工廠提供新的思路，并使其得以實現。

2.1 轉錄組學(Transcripomics)

利用DNA芯片對比分析細胞mRNA，一般分為以已知的DNA序列為基礎的寡核苷酸陣列、cDNA微陣列及EST分析等技術;或對未知序列信息進行分析的基因表達系列分析(SAGE)、差異消減雜交(SSH)等技術。近年來，對曲霉菌轉錄組的研究也取得了一定進展。Guillemette、Levin及Jacobs等人提供了一種整合轉錄組及蛋白質組的方法，從而改善了黑曲霉的蛋白分泌能力［16-18］。Anderson通過基因芯片對黑曲霉、米曲霉及構巢曲霉的比較轉錄組分析結果鑒定得到了曲霉菌中的23個保守基因及365個差異表達蛋白［19］。而DNA微陣列技術也被應用于對米曲霉的比較轉錄組分析中［20］，這種技術可以有效的對曲霉菌的代謝產物進行鑒別，為工業新蛋白的開發利用提供了新的工具。

2.2 蛋白質組學(Proteomics)

有關曲霉菌蛋白質組學方面的研究，在近5年逐漸引起人們的關注，新增了大量基礎研究數據。大量序列被分析并公布其結果，蛋白質組學的研究技術得到快速的發展。微生物的蛋白質組學研究目前主要有3種策略:一是表達蛋白質組學，二是比較蛋白質組學，三是免疫蛋白質組學。建立在二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和質譜的基礎上涌現了大量的新技術，為準確而大規模獲取蛋白質組有效數據提供了有效的手段。其中包括蛋白質標準絕對定量技術(protein standard absolute quantification，PSAQ);多連體定量標準技術(quantitative concatenated standard，QconCAT);蛋白豐度的絕對定量(absolute quantification of abundance，AQUA);細胞培養的氨基酸穩定同尾數標記技術(stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC);同位素親和標簽技術(isotope-coded affinity tags，ICAT);等量標記的相對和絕對定量技術(isobaric tag for absolute and relative quantificationi，TRAQ);串聯質譜標簽(tandemmass tags，TMT);同位素蛋白標記技術(isotopecoded protein labelling，ICPL)等。技術的發展也使曲霉菌的蛋白質組學研究取得了突飛猛進的成果，Teutschbein 等［21］對煙曲霉(Aspergillus fumigatus)分生孢子的蛋白質組學分析，推測分生孢子的復雜蛋白質組成與其應激抗性以及快速萌發有著密切關系。對萌發的煙曲霉分生孢子的研究顯示:CipC-like蛋白是一種菌絲特異性蛋白，這種胞內蛋白的生物學功能尚不明確，推測其可能與侵襲性生長相關。2005 年，Schwienbacher［22］對煙曲霉的主要分泌蛋白進行分析，鑒定確定其分泌組中包含多種代謝相關酶，如核糖核酸酶(與抑制真核蛋白合成相關)、脫乙酰幾丁質酶chiB及β-1，3內切葡聚糖酶兩種細胞壁多聚物降解酶。Adav等應用iTRAQ技術［23］對不同pH下的黑曲霉分泌蛋白質組的分析表明:黑曲霉的蛋白質組組成可通過調節pH發生顯著的變化，即一些特定酶的生產可通過調節培養基的pH完成。除了對胞內蛋白質組，分泌蛋白質組的研究外，對曲霉的亞蛋白質組，細胞壁及膜蛋白的蛋白質組的研究也逐漸成為又一個新的熱點。

表2 曲霉菌的公共基因組網址Table 2 Public genome websites for different Aspergillus species

2.3 代謝組學(Metabolomics)

繼基因組學及蛋白質組學之后，基于高通量定量分析生物體內所用代謝物的思路，代謝組學得以發展起來。其主要技術手段包括核磁共振(NMR)，質譜(MS)，色譜(HPLC，GC)以及氣質聯用(GCMS)，液質聯用(LC-MS)和氣相色譜-飛行時間質譜儀(GC-TOF)等。由于代謝物的濃度是直接與代謝途徑相關的，因此對曲霉菌代謝組的分析可以有效的指導我們應該對菌株的哪些代謝途徑進行改造，為合理構建并優化曲霉菌細胞工廠奠定基礎。Kouskoumvekaki［24］等對重組曲霉菌代謝組學研究，在對450種重組菌代謝物的鑒定分析中發現，其中7種代謝物可以作為生物標記用于菌株的基因型鑒定。2008年，基于基因組數據庫及擴展數據，Andersen［25］等和 Vongsangnak［26］等分別建立了黑曲霉及米曲霉的代謝網絡。而Microbia公司結合了轉錄組學及代謝組學的分析，對土曲霉調控基因進行改造，使其洛伐他汀(lovastatin)的生產力提高了50%，為工業生產力的提高提供了更大的創造空間［27］。

3 新構思及展望

3.1 后基因組時代的新產品

由于曲霉菌被做為食品工業、醫藥工業、酶制劑工業等多方面領域的細胞工廠的地位得以肯定，在曲霉菌基因組的研究已獲得了大量數據的基礎上，對曲霉菌新一輪的基因組挖掘(genome mining)正如火如荼的進行著。事實上，對基因組的分析結果已揭示了比預期更多的次級代謝生物合成過程。典型的曲霉菌基因一般存在30～40個基因簇，為系統挖掘這些基因簇的功能并繪制圖譜，已在互聯網上開放了一些生物信息工具。網絡工具SMURF(Secondary Metabolite Unknown RegionsFinder;www.jcvi.org/smurf/)就是其中之一。然而，大多數的次級代謝物基因簇由于基因沉默等原因，不能在實驗室或工業生產的條件下得到表達。為激活并表達這些沉默的基因簇，學者們采用了多種技術手段，并使其能有效的在工業生產中應用。其中不乏一些行之有效的案列，Bergmann等［28］于2007年通過操控激活一個轉錄因子的特定通路，激活了模式菌株(構巢曲霉)的一條沉默代謝通路，使得兩種全新的次級代謝產物得以鑒定。而Bok［29］通過定向操縱染色質狀態，去除一個染色質中的沉默基因，使至少兩個基因簇被激活表達。2010年，Jorgensen等［30］控制黑曲霉的生長條件，使其處于接近零生長率的狀態，從而誘導黑曲霉的特殊次級代謝物基因簇發生表達。因此綜合多種技術手段使曲霉菌潛在次級代謝物的開發具有更大的可能性。

越來越多的報道表明，曲霉菌的代謝產物具有極大的商業潛力:其中多不飽和脂肪酸可作為食品添加劑或是燃料原料;聚酮化合物及非核糖體肽具有潛在的藥物治療作用;類異戊二烯被認為是一種全新的健康食品;脂肽以及AFP源蛋白可作為抗真菌劑等等。隨著基因工程技術的成熟并不斷更新，為曲霉菌的開發開辟更多新的途徑，未來也將使更多非真菌源的化合物可被曲霉菌表達生產，在不遠的未來曲霉菌定將成為多目標表達的平臺。

3.2 展望

為充分探索和利用曲霉菌使其成為一個多目標表達平臺，學者們不斷提出更多的新概念新構想。如在新的生產菌種開發中應盡可能的全部去除非目的次級代謝物基因簇，并以此作為工業生產分級的標準，即在對產品質量水平要求不同的工業領域(如燃料原料、飼料、食品、酶制劑、醫藥等)時，應對應不同要求開發不同的菌株。應根據曲霉的密碼偏好型篩選曲霉菌或非真菌源的基因或基因簇，并在基因座中插入表達構建體(expression constructs)，以使曲霉菌的基因表達得到最有效的操控。

此外，細胞器工程的發展也為曲霉菌細胞工廠的開發提供了一個新的構思。胞內蛋白可以通過peroxicretion途徑［31］進行分泌(一種新的真核細胞的分泌途徑，該途徑通過在過氧化物酶體上人工裝飾高爾基體源的V-SNARE，使過氧化物酶體與細胞膜融合，再利用過氧化物酶的分泌囊泡將胞內蛋白質釋放到胞外)。

將曲霉菌生物技術、系統生物學工具以及代謝工程成功相互融合的關鍵，不僅要標準化控制曲霉菌培養生產的過程，更要通過生物信息學方法將獲得的轉錄組、蛋白質組代謝組等大量組學數據合理有效的分析得到正確推論。建立以基因組為基礎的代謝模型并對代謝流合理分析是鑒定限制性通路并預測有益代謝工程的關鍵。而對曲霉菌的細胞生物學研究(諸如細胞的體內影像監控研究in vivo live imaging)對全面地了解曲霉菌的細胞內工作過程也是必不可少的。這些新思路的提出必將促使曲霉菌細胞工廠的開發應用走上一個嶄新的階段。

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