維康醇對DNA拓撲異構酶活性的影響

歷文，尹曉慧，段麗麗，陳杰鵬，周雪瑩，朱曉琳，牛哲峰，張美俠

（1.中國醫科大學藥學院臨床藥理教研室，沈陽 110001；2.齊魯制藥有限公司研發部，濟南 250100；3.廣東汕頭保稅區雙駿生物科技有限公司應用生物技術研究所，廣東 汕頭 515071）

紫杉烷類的代表藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紫杉樹樹皮中提取的一種天然植物類抗腫瘤藥物。研究證實，PTX是乳腺癌、卵巢癌及非小細胞肺癌的一線和二線治療藥物，并可用于治療頭頸癌、食管癌、精原細胞瘤和復發性非霍奇金淋巴瘤等［1～5］。維康醇是利用高產PTX菌種發酵生產的新型單體化合物，本實驗室前期研究結果證實：維康醇對肝癌、胰腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細胞株具有增殖抑制作用，可引起細胞周期阻滯并誘導細胞自噬和凋亡，但其具體的作用靶點尚不清楚。DNA拓撲異構酶（topoisomerase）參與DNA復制、轉錄、重組及修復等所有關鍵的細胞核內過程，是抗腫瘤研究的熱點。本研究擬探討維康醇對DNA拓撲異構酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

pBR322 DNA（產品號：D3050）、DNA 拓撲異構酶 Ⅰ（TopoⅠ）（產品號：D2240A）、ATP、（產品號：D4041）購自TaKaRa公司；DNA拓撲異構酶Ⅱα（TopoⅡα）（產品號：T8944-100UN） 購自 Sigma公司；10-羥基喜樹堿 （10-hydroxy camptothecin，10-HCPT）由沈陽藥科大學提供；依托泊苷（產品號：105007HN）購自山東齊魯藥業有限公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB）購自 Amresco公司；維康醇由廣東汕頭保稅區雙駿生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 TopoⅠ介導的解旋作用及藥物的影響：反應體系：pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅠbuffer 2 μL，DNA TopoⅠ1 U（1 U定義為在37℃、30 min內把0.5 μg/50 μL 的 supercoiled pBR322 DNA 轉換成100%的松散型酶的活性），0.1%BSA 2 μL，不同濃度（1，5，50 mmol/L）維康醇溶液 2 μL（實驗組）或不同濃度（5，50 mmol/L）10-HCPT 2 μL（陽性對照組），滅菌蒸餾水補足至20 μL。37℃反應30 min，加入5 μL的5×反應終止液（0.74%EDTA，50%丙三醇，0.1%溴酚藍顯色液）終止反應。在TAE緩沖液中行0.8%瓊脂糖凝膠電泳40 min（電壓50 V）。電泳結束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，應用 Tanon Gls凝膠圖像分析系統軟件在紫外燈下對電泳凝膠圖像進行觀察并拍照分析。實驗重復3次。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳法測定TopoⅡ的活性及藥物的影響：10×反應緩沖液（pH8.0 0.5 mol/L Tris-HCl，1.2 mol/L KCl，5 mmol/L DTT，0.1 mol/L MgCl2，5 mmol/L ATP） 2 μL，50 μg/mL BSA 1 μL，pBR322 DNA 0.5 μg，DNA TopoⅡ2 U，及不同濃度的維康醇溶液 2 μL（實驗組）或依托泊苷溶液 2 μL（陽性對照組），滅菌蒸餾水補足至 20 μL。37℃反應30 min，加入5 μL的5×反應終止液終止反應，在TAE緩沖液中行0.8%瓊脂糖凝膠電泳40 min（電壓50 V）。電泳結束后 EB（0.5 μg/mL）染色 30 min，應用 Tanon Gls凝膠圖像分析系統軟件在紫外燈下觀察電泳凝膠圖像并拍照分析。實驗重復3次。

2 結果

2.1 維康醇對TopoⅠ介導的解旋作用的影響

TopoⅠ切斷DNA雙鏈中的1股，使DNA雙鏈在解鏈旋轉中不致打結，適當時候再把切口封閉，使DNA變為松弛狀態，從而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。利用TopoⅠ介導的負超螺旋pBR322 DNA解旋作用，觀察維康醇對TopoⅠ活性的影響。結果如圖 1所示：超螺旋 DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅠ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），隨著陽性對照藥物10-HCPT濃度的升高，抑制了TopoⅠ介導的對pBR322 DNA的解旋作用（lane E），不同濃度的維康醇對TopoⅠ介導的pBR322 DNA解旋無明顯影響（lane Alternol）。

2.2 維康醇對TopoⅡ介導的解旋作用的影響

如圖2所示：超螺旋DNA（pBR322 DNA，lane D）在TopoⅡ作用下解旋呈松散型DNA（lane T），不同濃度的陽性對照藥物依托泊苷均對TopoⅡ介導的pBR322 DNA解旋有抑制作用（lane E），不同濃度的維康醇對TopoⅡ介導的pBR322 DNA解旋有明顯抑制作用，在濃度達到5 μmol/L時抑制作用與依托泊苷5 μmol/L時的抑制作用相近（lane Alternol）。

3 討論

DNA拓撲異構酶是廣泛存在于真核和原核生物體內的基本酶之一，參與DNA復制、轉錄、重組及修復等所有關鍵的細胞核內過程，在細胞生命過程中起重要作用。TopoⅠ通過調節超螺旋、連鎖、去連鎖以及核酸解結作用，影響DNA拓撲結構［6］；TopoⅡ在腫瘤細胞中的含量及活性遠遠高于正常細胞，通過調節核酸結構動態變化，在DNA復制完成后使相互交聯的姐妹染色體分開，與腫瘤的發生、發展以及防治等有密切關系。由于DNA超螺旋程度影響著機體的活動，而拓撲異構酶的作用正是控制DNA的空間構型酶，因此，該酶被列為篩選抗腫瘤藥物的重要靶酶［7～9］。

從天然藥物中篩選高效低毒的抗腫瘤藥物是獲取抗腫瘤藥物的重要策略。本實驗室的前期研究結果表明：維康醇有抑制肝癌細胞增殖、引起細胞周期阻滯和誘導細胞自噬和凋亡的作用。本研究以DNA拓撲異構酶為靶點探討維康醇對DNA拓撲異構酶活性的影響，分別采用1 U TopoⅠ和2 U TopoⅡ的反應體系進行研究（經實驗表明，1 U TopoⅡ的反應體系對DNA的解旋作用效果并不明顯，因此選用2 U TopoⅡ的反應體系進行實驗）。本研究結果表明：維康醇能明顯抑制TopoⅡ的活性，抑制其介導的DNA解旋或斷裂，但對TopoⅠ的活性幾乎無影響，因此我們推測維康醇對腫瘤細胞的抑制作用可能與其抑制TopoⅡ的活性有關，TopoⅡ可能是其抗腫瘤作用的細胞內靶點之一，且維康醇對TopoⅡ的抑制作用與同濃度陽性對照藥依托泊苷相似，未來有可能成為TopoⅡ抑制劑依托泊苷的代替品。因此，維康醇是值得關注的抗腫瘤藥物。拓撲異構酶抑制劑按藥物作用方式可分為拓撲異構酶毒劑和拓撲異構酶阻遏劑；按藥物與DNA的結合方式可分為DNA嵌入劑和DNA非嵌入劑。關于維康醇具體屬于哪一種拓撲異構酶抑制劑仍有待進一步研究確認［10，11］。

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