腦外傷小鼠海馬TNF-α表達的變化

仇波，劉源，王勇

（中國醫科大學附屬第一醫院神經外科，沈陽 110001）

近年來，腦外傷發生率明顯增加。目前關于顱腦損傷的研究側重于如何防治繼發性腦損害，例如腦水腫、腦缺血缺氧、神經元凋亡等。人類海馬區神經元與學習記憶緊密相關，且對腦外傷極為敏感，傷后神經元大量變性壞死，導致患者學習記憶功能障礙［1］。因此，研究腦損傷后海馬神經元的凋亡與損傷機制具有重要意義。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，一般情況下適量TNF-α具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等作用［2］；也可通過多種機制作用于中樞神經系統，調節神經—內分泌功能、介質釋放、抗原遞呈等［3］。目前有研究表明TNF-α與腦損傷后的繼發性缺血關系密切［4，5］，然而腦外傷后小鼠海馬的TNF-α表達情況尚不清楚。本研究擬通過自由落體法復制閉合性腦外傷小鼠模型，探討腦外傷后小鼠海馬TNF-α的表達變化。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

羊抗小鼠 TNF-α（Sigma公司），兔抗羊 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），S-P免疫組化染色試劑盒與DAB顯色試劑盒（福州邁新），高速離心機（上海醫用分析儀器廠），OLYMPUS光學顯微鏡（Olympus公司），Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司）。

1.2 動物模型的建立及分組

Balb/c系雄性小鼠60只，體質量20～25 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。隨機分為假手術組（30只）和腦外傷組（30只）。采用改良的自由落體法復制閉合性腦外傷小鼠模型，打擊裝置由腦立體定向儀、垂直導管、下落砝碼、頂端涂有聚乙烯的撞針組成、撞針底端直徑3 mm，異氟烷吸入麻醉小鼠后，將頭部固定于腦立體定向儀上，消毒，沿中線切開頭皮，暴露頭蓋骨，分離骨膜，將撞針置于前、后囟門中點偏左1 mm，以40 g砝碼從25 cm高處沿垂直導管自由下落，撞擊撞針造成腦損傷，縫合頭皮，給予充足水和食物喂養，假手術對照組僅切開頭皮暴露顱骨，不實施打擊。

腦外傷后，根據小鼠腦損傷NSS評分系統進行評分：單側或雙側偏癱（1分），無法于3 cm平衡木上行走（1分），無法在2 cm平衡木上行走（1分），無法在1 cm平衡木上行走（1分），無法在0.5 cm平衡木上站穩（1分），無法在直徑0.5 cm平衡木上站穩（1分），2 d內無法走出直徑30 cm圓圈（1分），不能走直線（1分），驚嚇反射消失（1分），探尋反射消失（1分），總分10分。重度損傷為7～8分，中度損傷為5～6分，輕度損傷為4分。

本研究篩選7～8分重度腦外傷小鼠作為研究對象。其中腦外傷組按 6 h、1 d、3 d［4］各選取 8 只，隨機分配進行免疫組化、Western blot和RT-PCR檢測；假手術組也按照6 h、1 d、3 d時間點各隨機抽取8只分配后行上述檢測。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：取各組小鼠分別于假手術、腦損傷后 6 h、1 d，3 d，以 0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，固定，斷頭取腦置于4%多聚甲醛后固定12 h，移入30%蔗糖溶液至沉淀。乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作連續冠狀腦切片，切片厚8 μm，切片常規脫蠟至水，按S-P試劑盒說明書測定TNF-α的表達。

1.3.2 Western blot：各組小鼠以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，冰上斷頭取海馬，超聲粉碎，離心取上清，以考馬斯亮藍G250結合法測定樣品蛋白含量，等量蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉印，雜交，暗室內ECL反應，X線片顯影、定影，凝膠圖像分析儀采集分析光密度值（mean optical density，MOD），TNF-α 蛋白的 MOD 與內參照β-actin的MOD比值為相對表達量。

1.3.3 RT-PCR：麻醉處死各組小鼠，冰上斷頭取海馬，按RNAout說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉錄（RT法）先合成cDNA，再進行PCR擴增；TNF-α 上游引物：5′-CGAGTGACAAGCCCGTAGCC-3′；下游引物：5′-GGATGAACACG CCAGTCGCC-3′，擴增產物全長 255 bp；β-actin 的上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物：5′-GCGGGGCA TCGGAACCGCTCA-3′，擴增產物全長374 bp。擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。用目的基因與β-actin光密度的比值代表目的基因的相對表達含量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計分析，結果用±s表示，各組比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

結果顯示，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達腦外傷6 h迅速升高，為0.25±0.08；1 d時的表達量最高，為0.59±0.23；3 d 時表達已降低，為 0.47±0.21；腦外傷組各時間點（6 h、1 d、3 d）TNF-α 蛋白表達與假手術組（各時點分別為 0.11±0.02，0.13±0.05，0.14±0.03）比較均顯著升高（P<0.05，圖1）。

2.2 Western blot結果

根據蛋白免疫印跡結果可以看出，在小鼠腦外傷后6 h，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達迅速升高，相對表達量為0.33±0.06；到1 d時，TNF-α蛋白的表達量最高（0.69±0.31），到 3 d時，TNF-α 蛋白的表達已降低（0.57±0.28）；腦外傷組各時間點（6 h、1 d、3 d）TNF-α蛋白的表達與對應時間假手術組（0.17±0.03，0.20±0.05，0.17±0.04）比較均顯著升高（P<0.05，圖 2）。

2.3 RT-PCR結果

小鼠腦外傷6 h相對表達量為0.43±0.21，1 d的相對表達量為0.82±0.15，3 d的相對表達量為0.63±0.27，均比假手術組對應時間點的相對表達量（0.30±0.09，0.34±0.12，0.29±0.11）顯著升高（P<0.05，圖 3）。

3 討論

顱腦損傷后血腦屏障受損，影響腦的正常代謝，自由基產生增多、胞質鈣離子超載、中樞神經遞質紊亂，加劇了繼發性損害，引起腦缺血缺氧及腦水腫［6，7］。近幾年顱腦損傷的研究進展主要集中在腦組織損傷后繼發性神經細胞損害，尤其是顱腦損傷后的缺血缺氧性損傷。研究發現，TNF-α是介導腦缺血性損傷的主要遞質之一，也是腦創傷后血管源性腦水腫形成的重要原因［8，9］。

本研究利用免疫組織化學方法和Western blot方法檢測腦外傷小鼠海馬TNF-α蛋白表達時發現，在腦外傷后6 h后，小鼠海馬TNF-α蛋白的表達迅速升高，到1 d時，TNF-α蛋白的表達量最高，到3 d時，TNF-α蛋白的表達已開始降低。用RT-PCR方法對腦外傷小鼠海馬的TNF-αmRNA檢測發現，6 h組小鼠TNF-αmRNA表達量已顯著升高，1 d時表達量最高，到3 d時略有降低。以上結果提示，TNF-α作為機體炎性反應和免疫應答的重要因子，在閉合性顱腦損傷后小鼠海馬的表達顯著升高，可能參與了海馬繼發性缺血缺氧等病理生理過程，從而加重神經元損傷，甚至遲發性神經元死亡等［10］。TNF-α可能由神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞甚至肥大細胞等產生和釋放，改變血腦屏障的通透性，加重炎性反應和組織水腫，導致神經功能障礙［9］。由于腦組織內大量存在腫瘤壞死因子受體，TNF-α表達升高后，可以廣泛作用于腦組織，并參與多種繼發性病理生理反應，導致局部和廣泛性的腦組織二次損害。

腦外傷是成年人致死和致殘的重要原因，因此對腦損傷進行深入研究對臨床醫學和基礎醫學都具有現實意義。90%創傷性腦損傷死亡患者都有缺血性改變，是繼發性損傷的主要機制。海馬是腦內的重要結構，同時也是對原發腦損傷和繼發腦缺血非常敏感的區域。本研究結果顯示腦損傷后小鼠海馬TNF-α表達明顯升高，提示其可能與海馬的繼發性缺血損傷有密切關系。

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