血管周圍脂肪組織中AngⅡ介導血管平滑肌細胞增殖的機制

史吉瑩，劉唐威，楊國勛，黃江南，宋夢瑩，錢靜

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院高血壓病區(qū)，南寧 530021）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖在血管重構的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用［1，2］。多種生物活性物質(zhì)通過不同的信號傳導途徑參與了VSMC的增殖過程，其中氧化應激觸發(fā)的氧化還原信號途徑已經(jīng)成為防治血管增殖性疾病的研究方向［3，4］。我們之前的研究已證實血管周圍脂肪組織（perivascular adipose tissue，PVAT）是局部的RAS系統(tǒng)，可產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），與高血壓血管重構相關。同時，PVAT也是產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）的重要來源［5］，含有產(chǎn)生 ROS的 NAD（P）H 氧化酶系，而AngⅡ可以刺激NAD（P）H產(chǎn)生超氧化物。因此，本實驗通過培養(yǎng)VSMC細胞、檢測VSMC增殖指標表達來探討在PVAT中ROS介導AngⅡ誘導VSMC增殖及遷移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 平滑肌細胞培養(yǎng)

取大鼠胸主動脈環(huán)，去除血管外膜和內(nèi)膜，將中膜剪成1個1 mm2大小組織塊，采用貼壁法自原代細胞開始培養(yǎng)，置入10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，實驗選用4～10代培養(yǎng)細胞，細胞在光鏡下呈典型峰谷狀表現(xiàn)，α-actin檢查呈陽性染色。以傳代培養(yǎng)法調(diào)整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔細胞培養(yǎng)板。

1.2 主要試劑和儀器

AngⅡ（Sigma，貨號 A9525）、apocynin（Sigma，貨號 A10809）、catalase（Sigma，貨號 C1345）、PD98059（Sigma，貨號P215）、牛磺酸（國藥集團化學世界有限公司，批號 F20090223）、DTNB （Sigma，貨號43760）、α-actin抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所）、細胞DNA含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）、過氧化氫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、流式細胞儀（美國貝克曼公司，型號LX-20）、熒光酶標儀（型號FLX800，美國）。

1.3 活性氧檢測

將細胞種于6孔，板待貼壁后用無血清培養(yǎng)液按1∶1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，收集細胞制備成單細胞懸液。使用熒光酶標儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，實時檢測熒光的強度。

1.4 實驗分組

1.4.1MTT分析法：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽檢測AngⅡ誘導平滑肌細胞增殖：按照時間分為：（1）正常對照組：不含任何藥物的培養(yǎng)液；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）分別處理 12 h、24 h、48 h。按照濃度分為：（1）正常對照組：不含任何藥物的培養(yǎng)液；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ （終濃度分別為 1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L）處理24 h。采用MTT分析血管平滑肌細胞增殖率。

1.4.2 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對AngⅡ誘導平滑肌細胞增殖、H2O2及HOCL的影響：實驗分組為（1）對照組：未給予任何藥物處理；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理 24 h；（3）apocynin+AngⅡ處理組：預先給予apocynin（終濃度 400 μmol/L）處理 20 min，然后 AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理 24 h；（4）catalase+AngⅡ處理組：預先給予catalase（終濃度300 nmol/L）處理2 h，然后AngⅡ（終濃度100 nmol/L）處理24 h；（5）PD98059+AngⅡ處理組：同時給予 PD98059（終濃度 10 μmol/L）及 AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理24 h。采用蛋白定量、流式細胞術分析血管平滑肌細胞總蛋白含量及細胞周期進程。采用比色法檢測H2O2和HOCL水平。

1.5 MTT

取對數(shù)生長期的成纖維細胞，胰酶消化后制備細胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/mL，加入96孔培養(yǎng)板中。待細胞貼壁后按上述步驟處理和備用細胞。每個實驗組6個復孔。常規(guī)操作，在酶標儀492 nm處測定光密度（optical density，OD）值。

1.6 細胞總蛋白含量分析

各孔加入100 μL組織細胞裂解液，吸取裂解液至0.5 mL干凈EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清；根據(jù)樣品數(shù)量，BCA試劑A加BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分混勻；PBS完全溶解蛋白標準品，取 10 μL稀釋至 100 μL，使終濃度為 0.5 mg/mL；將標準品按 0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標準品孔中，PBS補足到20 μL；加入5 μL蛋白樣品到96孔板的樣品孔中，PBS補足到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min；測定A570波長吸光值，根據(jù)吸光值和蛋白標準品計算出標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算出各樣品蛋白濃度。

1.7 細胞周期檢測

將待測樣本制成單細胞懸液，4℃預冷PBS洗滌1次；2 000 r/min離心5 min，收集并調(diào)整細胞濃度為1×106/mL；制備單細胞懸液用70%乙醇固定，4℃保存；取1 mL細胞懸液，加100 μL RNaseA 37℃孵育30 min；再加入300 μL PI混勻即可進行流式細胞分析。

1.8 細胞H2O2水平檢測

空白管、標準管、測定管各加入1 mL試劑一（37℃預溫），上述各管分別加入蒸餾水、H2O2標準品應用液（163 mmol/L）、待測樣本均為 100 μL，混勻后37℃反應1 min，各管分別加入1 mL試劑二，混勻，于405 nm處測各管吸光度值。按照南京建成生物工程研究所提供的計算公式計算出H2O2的濃度。

1.9 細胞HOCL水平檢測

細胞處理后，取培養(yǎng)上清70 μL，加入牛磺酸（40 mmol/L）25 μL，反應 5 min 后，加入 1 mmol/L 5，5′-二硫-2-酸硝基苯甲酸 （5，5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）5 μL 反應 5 min 后測定吸光度。在整個反應體系中，HOCL氧化牛磺酸生成牛磺酸氯胺，牛磺酸氯胺最后氧化DTNB生成5-硫-2-硝基苯甲酸 （5-thio-2-nitrobenzoic acid，TNB）。由于TNB在波長412 nm處有一特異性最大吸收峰，因此測定在A412處吸光度可以反映HOCL的水平。

2.0 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有檢測指標均進行正態(tài)性檢驗，各計量資料數(shù)據(jù)以±s表示。經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊性時，兩組間差異性比較采用t檢驗，方差不齊時用t′檢驗；多組間比較采用Oneway ANOVA和Student-Newman-Keuls多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 平滑肌細胞的鑒定

鏡下見以平滑肌細胞為主的纖維樣細胞呈梭形、長梭形或帶狀，核卵圓形居中。局部成束的細胞平行排列，部分區(qū)域細胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰—谷”狀生長。培養(yǎng)第5代細胞經(jīng)特異的平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學染色后，高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)大量棕色、與細胞長軸平行的纖維細絲，即平滑肌α-肌動蛋白絲。核卵圓形居中，呈淡藍色。見圖1。

2.2 MTT試驗結(jié)果

平滑肌細胞在AngⅡ以濃度1 μmol/L，即終濃度為100 nmol/L處理24 h后，與其他不同處理時間不同濃度比較（除外處理48 h的10 μmol/L濃度組）增殖明顯（P＜0.05），見表1。

表1 細胞經(jīng)不同濃度A n gⅡ處理后不同時間M T T的O D值（±s）T a b.1 O D v a l u e s o f M T T a f t e r t r e a t m e n t b y A n gⅡ a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e p o i n t s（±s）O D v a l u e o f M T T 1 2 h 2 4 h 4 8 h 1 0 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 5 4 0±0.0 1 9 8 0.4 3 4 2±0.0 2 0 6 0.4 5 5 6±0.0 3 1 2 1 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 2 8±0.0 2 6 9 0.4 5 1 6±0.0 2 1 7 0.5 2 4 4±0.0 4 1 4 1 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 9 2±0.0 3 4 4 0.5 2 3 4±0.0 0 7 4 1） 0.5 0 6 2±0.0 2 4 2 1 0 0 n m o l/L g r o u p 0.1 6 6 2±0.0 0 9 5 0.3 0 7 2±0.0 4 9 8 0.4 6 4 0±0.0 2 2 8 1 0 n m o l/L g r o u p 0.1 1 2 8±0.0 0 5 1 0.1 4 9 0±0.0 1 3 7 0.1 1 8 8±0.0 0 4 8 1）P ＜ 0.0 5 c o m p a r e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d i f f e r e n t p r o c e s s i n g t i m e s i n a d d i t i o n t o 1 0 μ m o l/L c o n c e n t r a t i o n a t 4 8 h.G r o u p

2.3 AngⅡ處理后對ROS影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細胞后，檢測細胞ROS水平（OD值），結(jié)果顯示，與正常對照組（23.17±1.5）比較，AngⅡ處理組（55.33±1.4）ROS顯著增高（P＜0.05）。

2.3 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對AngⅡ誘導平滑肌細胞總蛋白合成的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細胞后，檢測細胞總蛋白，結(jié)果顯示AngⅡ處理后總蛋白水平由處理前的（0.413±0.006）mg/mL升高至（0.619±0.042）mg/mL，說明AngⅡ處理后能明顯增加平滑肌細胞DNA合成能力（P＜0.05），預先給予apocynin、catalase及PD98059與單用AngⅡ比較總蛋白合成分別下降至（0.471±0.008），（0.496±0.014），（0.448±0.013）mg/mL（P ＜ 0.05）。

2.4 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對AngⅡ誘導平滑肌細胞周期的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細胞后，采用流式細胞術分析細胞周期進程情況。結(jié)果顯示，與正常對照組比較，AngⅡ處理組細胞周期中 G1期降低，S期明顯增高（P＜ 0.05），說明 AngⅡ具有明顯誘導血管平滑肌細胞分裂、增殖的作用；預先給予 apocynin、catalase及 PD98059處理后，G1期增加，S期降低，說明這3種藥物可抑制AngⅡ的促細胞增殖效應（P ＜ 0.05），見表 2，圖 2。

表2 藥物干預對血管平滑肌細胞細胞周期進程的影響（±s）Tab.2 Ef f ecton VSM C cycl e progressi on w i t h AngⅡt reat m entat di f f erentconcent rat i ons（±s）Group G1 S Control 58.02±0.29 37.40±0.72 AngⅡ 49.37±1.231） 45.62±0.351）AngⅡ+apocynin 55.93±0.472） 41.84±0.452）AngⅡ+catalase 54.19±1.072） 43.04±0.312）AngⅡ+PD98059 57.59±0.082） 40.89±0.282）1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs AngⅡgroup.

2.5 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對AngⅡ誘導平滑肌細胞增殖時H2O2、HOCL的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細胞后，采用比色法檢測H2O2、HOCL水平，結(jié)果顯示在 AngⅡ處理組 H2O2水平［（1.223±0.255）mmol/L］顯著高于對照組［0.362±0.032）mmol/L］（P ＜ 0.05），預先給予apocynin、catalase與單用AngⅡ比較H2O2水平分別為（0.680±0.020）mmol/L、（0.315±0.034）mmol/L（P ＜ 0.05）；而 PD98059 為（1.040±0.161）mmol/L，對AngⅡ誘導H2O2生成無明顯影響（P＞0.05）。

在AngⅡ處理組HOCL OD值為0.101±0.003，顯著高于對照組（0.038±0.004，P ＜ 0.05），預先給予apocynin、catalase與單用AngⅡ比較HOCL OD值分別降至 0.078±0.001、0.036±0.010，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；而 PD98059（0.092±0.004）對 AngⅡ誘導的HOCL生成無明顯影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 AngⅡ誘導VSMC增殖

本實驗結(jié)果顯示，AngⅡ處理后可促使VSMC增殖，同時伴有ROS增高，說明在AngⅡ誘導的細胞增殖過程中，ROS可能參與其中。適量ROS是維持細胞生長和機體抗感染所必需的，但過量ROS可對機體造成病理生理損害［6］。本實驗中AngⅡ處理組較正常組ROS水平增高。ROS是調(diào)節(jié)VSMC增殖、肥大和遷移的重要信號分子［7］。在我們之前的動物實驗中，已證實PVAT可產(chǎn)生AngⅡ，并與高血壓血管重構相關［8］。近年來，ROS被證明為細胞內(nèi)信號分子，誘導細胞的增殖［9，10］。因此推斷在 PVAT AngⅡ誘導高血壓血管重構的機制中ROS作為信號分子參與其中。ROS可激活特異性的信號傳導途徑、協(xié)調(diào)病理生理反應、打開細胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應，影響血管重構時細胞進程［11］。

3.2 ROS介導AngⅡ誘導VSMC增殖的機制

在AngⅡ誘導VSMC增殖的過程中，何種ROS在激活氧化還原信號途徑中起主要作用尚不清楚。大多數(shù) ROS（如 O2-、OH-、ONOO-等）性質(zhì)高度活潑，極不穩(wěn)定。相對而言，H2O2比較穩(wěn)定，且容易在細胞內(nèi)和細胞間擴散，因此H2O2極可能是啟動氧化還原信號途徑的分子。在本實驗中，AngⅡ處理后在明顯誘導VSMC增生的同時，H2O2水平也隨著明顯升高，在給予 apocynin及 catalase后，AngⅡ誘導VSMC的增殖能力下降，并且H2O2水平亦顯著下降，提示H2O2為AngⅡ效應分子，且為 VADPH氧化酶（Nox）源性。這與很多研究中認為H2O2作為主要效應分子介導AngⅡ誘導的平滑肌細胞增殖以及血管重構的結(jié)果一致［12～14］。當H2O2在細胞內(nèi)大量堆積時，可能會激活細胞內(nèi)氧化還原信號多條途徑，生成大量HOCL等化學物質(zhì)。本實驗中，AngⅡ在誘導VSMC增殖的同時，同樣亦有HOCL的明顯升高，在預先給予apocynin及catalase后，這兩種效應同時降低，提示HOCL參與了AngⅡ誘導VSMC增殖的過程。研究報道，HOCL能促使ERK1/2磷酸化而誘導血管VSMC遷移，從而在血管重構中起著重要作用，而抗氧化劑和ERK1/2抑制劑能逆轉(zhuǎn)該效應［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在給予apocynin及catalase后，AngⅡ誘導細胞增殖能力下降的同時，H2O2及HOCL水平亦下降，而PD98059雖能抑制細胞增殖，卻未能降低H2O2及HOCL的水平，提示AngⅡ誘導VSMC增殖過程中的機制涉及Nox/H2O2/HOCL/ERK1/2途徑。

綜上所述，ROS在介導AngⅡ誘導VSMC增殖的過程中起著重要作用。以NADPH氧化酶源的H2O2為底物生成HOCL，從而激活ERK1/2，促進血管平滑肌細胞增殖，這為PVAT與血管重構的相關性研究提供了依據(jù)。

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