人線粒體轉錄因子A的表達與前列腺癌細胞順鉑耐藥性機制的研究

韓斌，白松，欒嵐，吳斌

（1.中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科，沈陽 110004；2.沈陽醫學院奉天醫院病理科，沈陽 110024）

前列腺癌是一種依靠雄激素成長的惡性腫瘤。由于它對雄激素的依賴性（androgen dependent），臨床上應用雄激素阻斷療法治療初發前列腺癌都會有很好的療效。然而，隨著腫瘤細胞的變異與進展，很多病例變為雄激素非依賴型（androgen independent），雄激素阻斷療法失去療效。而化學療法包括紫杉醇，唑來磷酸，順鉑等藥物對雄激素非依賴性前列腺癌的療效卻十分有限，探索雄激素非依賴性前列腺癌的耐藥機制具有十分重要的現實意義。本文通過雄激素非依賴型前列腺癌細胞系PC3的研究，探討TFAM的表達與順鉑耐藥性的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

PC3細胞，及由PC3細胞培育成的順鉑高耐受性細胞PCDP6由日本產業醫科大學分子生物學教研室提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：應用5%CO2，37℃培養箱進行細胞培養，培養基含10%FBS，10 000 U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素。

1.2.2 siRNA干擾：應用TFAM siRNA#1與siRNA#2［1］轉染 PC3 細胞。

1.2.3 Western blot：收集細胞后，提取細胞蛋白。應用SDS-PAGE電泳分離樣品蛋白質條帶，并應用濕轉法把蛋白樣品轉移到NC膜上。NC膜經一抗、二抗孵育，洗膜后發光實驗檢測蛋白表達水平。

1.2.4 順鉑對PC3細胞IC50的測定：將siRNA轉染干擾后的細胞懸液接種于96孔板，加入含不同濃度順鉑的培養液培養72 h。MTT法測IC50。應用χ2檢驗對比不同IC50，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐順鉑細胞高表達TFAM

相比于其母細胞系PC3，順鉑高耐受細胞PCDP6高表達TFAM與survivin（圖1），而作為內參的β-actin無變化。

2.2 低表達TFAM的PC3細胞對順鉑敏感性增強

當用小干擾RNA成功降低PC3細胞TFAM表達后（圖1），用不同濃度順鉑作用于細胞，繪制耐藥曲線，計算IC50。我們觀察到，TFAM表達降低后，PC3對順鉑敏感性增強，IC50明顯下降，P<0.05（圖2）。

2.3 TFAM可調控survivin的表達

轉染特異性 siRNA#1，#2到 PC3細胞降低TFAM表達后，Western blot結果顯示survivin的表達同樣降低。而作為內參的β-actin無明顯變化。

3 討論

TFAM是體細胞內重要的調控線粒體活性的因子蛋白，當線粒體DNA受到損傷時，TFAM可以特異性的結合存在損傷或變異的線粒體DNA序列上，穩定DNA結構，阻止由DNA損傷引發的凋亡［2，3］。研究證實，TFAM的表達在PC3細胞生長中發揮重要作用，并抑制細胞的凋亡［1］。但TFAM的表達與PC3細胞對化療藥物敏感性間的關系未見報道。順鉑是烷化劑類的細胞毒性藥物，可抑制癌細胞的DNA復制過程，較強的廣譜抗癌作用。癌細胞內，線粒體DNA由于缺乏核小體等結構的保護，極易受到順鉑的攻擊而損傷，從而誘導凋亡。而TFAM可特異性的結合在變異的線粒體DNA表面，起修復和保護的作用。這從理論機制上說明TFAM的表達可對抗順鉑的細胞毒性。本研究證實TFAM的表達與前列腺癌細胞的耐藥性呈正相關。耐順鉑的PCDP6高表達TFAM。而成功降低TFAM表達后，PC3細胞對順鉑IC50明顯下降。

最新的研究表明，降低survivin表達后，胃癌細胞對順鉑的敏感性增強［3］。survivin是廣泛高表達在于腫瘤細胞中的蛋白，它在腫瘤細胞內發揮重要的作用，包括與前列腺癌的分期分級正相關［4］。本研究發現，在PCDP6中，survivin表達升高，survivin在癌細胞耐受順鉑中發揮作用。而TFAM的表達可以促進survivin的表達，當用小干擾RNA降低TFAM蛋白表達后，survivin的表達同樣降低，TFAM與survivin的相關性說明TFAM也通過調控survivin參與對順鉑的耐藥。TFAM通過多種通路參與雄激素非依賴性前列腺癌細胞中對順鉑的耐藥機制，可以作為晚期前列腺癌的治療靶點。

［1］Han B，Izumi H，Yasuniwa Y，et al.Human mitochondrial transcription factor A functions in both nuclei and mitochondria and regulates cancer cell growth［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，29408（1）：45-51.

［2］Kang D，Kim SH，Hamasaki N.Mitochondrial transcription factor A（TFAM）：roles in maintenance of mtDNA and cellular functions［J］.Mitochondrion，2007，7（1-2）：39-44.

［3］Shen X，Zheng JY，Shi H，et al.Survivin knockdown enhance gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice［J］.Am J Med Sci，2012 Jan 18［Epub ahead of print］.

［4］于洪波，韓小兵，梁宜騫，等.OPN及survivin在前列腺癌組織中的表達及臨床意義［J］.南方醫科大學學報，2010，30（5），1141-1143.