TNF-α刺激人牙周膜細胞表達MMP-9的研究

趙戩，潘春玲，劉俊超，李倩，潘亞萍

（中國醫科大學口腔醫學院牙周科，遼寧省口腔醫學研究所牙周病學研究室，沈陽 110002）

牙周致病菌侵襲牙齦上皮細胞能夠誘導多種細胞因子如 TNF-α、IL-8 等的過度表達［1］，使組織細胞釋放較多的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），造成牙周組織中膠原纖維的降解［2］。當細菌侵入組織深處時，牙周膜細胞對牙周致病菌的反應將成為牙周組織繼續破壞的關鍵。本研究目的在于通過檢測不同濃度的TNF-α刺激人牙周膜細胞（humanperiodontal ligment cells，hPDLCs）表達MMP-9的水平，探討細菌、細胞因子和MMPs之間可能存在的復雜調控網絡在慢性牙周炎中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 hPDLCs的培養

刮取正畸原因拔除的健康無齲前磨牙的牙周膜組織，原代培養hPDLCs，取第4代細胞鑒定細胞來源，結果顯示抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證實來源于外胚間充質的hPDLCs。取第5代細胞用于實驗［3，4］。

1.2 TNF-α刺激hPDLCs

實驗組 1分別以不同濃度（1、2、5 ng/mL）的人重組TNF-α（博士德生物工程有限公司，武漢）與hPDLCs均勻混合24 h；實驗組2以2 ng/mL的TNF-α 分別處理 hPDLCs 6 h、12 h、24 h、48 h；未經刺激的hPDLCs作為對照組。收集細胞上清液，用于MMP-9濃度的檢測。

1.3 ELISA檢測MMP-9濃度

采用人MMP-9 ELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司，武漢）檢測TNF-α刺激后的hPDLCs培養上清液相應蛋白含量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 不同濃度的TNF-α刺激hPDLCs表達MMP-9的水平

0、1、2、5 ng/mL TNF-α 刺激 hPDLCs 24 h 表達MMP-9的水平分別為（0.628±0.314）ng/mL、（1.995±0.789）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（7.982±2.879）ng/mL。與對照組相比，各刺激組細胞表達MMP-9水平均顯著增高（P<0.01），且各刺激組組間差異具有統計學意義（P<0.01）（圖 1）。

2.2 2 ng/mL的 TNF-α刺激 hPDLCs不同時間MMP-9的表達水平

以2 ng/mL濃度的TNF-α分別刺激hPDLCs 6 h、12 h、24 h 及 48 h，hPDLCs表達 MMP-9 的水平分別為（1.074±0.427）ng/mL、（1.635±0.763）ng/mL、（4.129±1.525）ng/mL、（6.747±2.257）ng/mL。對照組（刺激0 h）的hPDLCs沒有檢測到MMP-9表達，6 h～12 h時MMP-9出現表達增強，之后持續增強。與6 h組對比，24 h、48 h組細胞上清中的MMP-9表達明顯增高，而且24 h與48 h組間差異具有統計學意義（P<0.01）。6 h組與12 h組間差異則無統計學意義（P ＞ 0.05）（圖 2）。

3 討論

在牙周致病菌突破牙齦上皮第一道防線后，細菌及細胞因子與hPDLCs反應所產生的局部環境決定著慢性牙周炎的轉歸。已有研究證實牙周致病菌侵襲牙周組織后產生的TNF-α能夠刺激多種細胞如成纖維細胞、牙齦上皮細胞等產生MMPs，但能否刺激人牙周膜細胞產生MMPs尚不十分清楚，國內尚未見報道。

本實驗發現，隨著TNF-α濃度增高、作用時間延長，hPDLCs產生MMP-9的水平隨之增高。表達顯著增高見于以2 ng/mL TNF-α刺激24 h以后。以5 ng/mL TNF-α刺激hPDLCs產生MMP-9的濃度是以0 ng/mL TNF-α刺激產生MMP-9的12.71倍；以2 ng/mLTNF-α刺激hPDLCs 48 h后產生的MMP-9濃度是刺激6 h的6.28倍。說明TNF-α以時間和劑量依賴的方式刺激hPDLCs表達MMP-9。

MMPs在慢性牙周炎致病過程中的牙周結締組織破壞和骨吸收中發揮重要作用。牙周致病菌能夠激活牙齦上皮細胞、hPDLCs產生多種細胞因子和MMPs［4］，它們參與并促進了牙周炎的發病過程。牙周致病菌在細菌-細胞相互作用中產生的細胞因子，與MMPs之間同時存在著復雜的相互作用［5，6］。

牙周致病菌在與牙齦上皮細胞、hPDLCs相互作用時，牙周組織局部產生較多的TNF-α。TNF-α是機體炎癥反應與免疫應答的重要調節因子，能夠誘導多種組織細胞表達MMP-9［7］。有證據顯示TNF-α對MMPs的誘導作用主要是通過MAPK信號系統介導的NF-κB通路激活的［8］。牙周致病菌通過與特異性宿主受體結合，黏附并侵入牙齦上皮細胞及hPDLCs，啟動細胞內信號通路，激活細胞因子網絡。目前已經證實MMP-9的基因啟動子位置存在于NF-κB、AP-1、SP-1 等多種核轉錄因子結合位點，促炎細胞因子可以通過這些位點上調MMP-9的表達［9，10］。其中，TNF-α 可能通過提高部分轉錄因子的活性誘導MMP-9表達。

本研究在國內首次證實了TNF-α以時間和劑量依賴性的方式刺激hPDLCs表達MMP-9，提示在牙周炎癥過程中，在促炎細胞因子TNF-α的刺激下，牙周組織的主要成分hPDLCs成為MMP-9的又一個重要來源。TNF-α誘導炎性細胞的浸潤和活化，MMP-9則為細胞遷移創造了條件。由此提示，細菌、細胞因子和MMPs三者發揮協同作用，形成了牙周致病菌、細胞因子、MMPs、細胞間基質及炎癥反應之間復雜的網絡關系，這與牙周炎的發生發展密切相關，為牙周病病因的研究提供理論依據。

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