中藥中速滅威殘留量的酶聯免疫檢測方法

張曙光，王俊平，生 威，張 燕，王 碩

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

中藥中速滅威殘留量的酶聯免疫檢測方法

張曙光，王俊平，生 威，張 燕，王 碩

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

建立了直接競爭酶聯免疫法(ELISA)測定金銀花、枸杞、人參、板藍根、大青葉和圓弧止痛片為代表的中藥中速滅威的殘留量．金銀花等經過粉碎，加入甲醇提取、旋蒸、PBS復溶等簡單前處理之后，再經過適度的稀釋可以達到消除基質影響，用ELISA進行測定．中藥樣品添加回收率為64.00%～91.30%，變異系數均小于30.12%．結果表明，該方法可以簡單、快速、靈敏、準確地檢測出金銀花、枸杞、人參、板藍根、大青葉和圓弧止痛片等中藥中速滅威的殘留量.關鍵詞：ELISA；中藥；速滅威；檢測

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑及儀器

金銀花(Lonicera chrysantha)、枸杞(Lycium chinense)、人參(Radix Ginseng)、板藍根(Radix Isatidis)、大青葉(Folium Isatidis)、元胡止痛片(Yuanhu painkillers)，天津市塘沽區某藥店；速滅威標準品、吐溫20、3，3'，5，5'–四甲基聯苯胺(TMB)，美國Sigma公司；小牛血清蛋白(BSA)，Merck 公司；速滅威抗體、辣根過氧化物酶(HRP)酶標抗原，天津市食品營養與安全重點實驗室．

酶標儀，Thermo 公司；單道、8道微量可調移液器，Gilson 公司；渦旋混合器，北方同正公司；離心機，德國Eppendorf公司；旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；442404酶標板，NUNC公司．

1.2 直接競爭酶聯免疫法的建立

包被：抗體每孔1,μg包被在酶標板上，室溫孵育過夜或37,℃孵育3,h，PBST洗板3次．

封閉：用封閉液(每孔200, μL，1%BSA)室溫封閉1,h，然后棄去封閉液，PBST洗板3次．

酶標抗原和標樣(或樣品提取液)：每孔先加入100,μL速滅威標準品溶液或樣品提取稀釋液，再加入100,μL適當稀釋度的酶標抗原，以不加速滅威標樣的孔為對照．室溫孵育1,h，PBST洗板4次．

顯色：在每個孔中加入150,μL顯色液3，3'，5，5'–四甲基聯苯胺(TMB)進行顯色，加入底物溶液后，底物在酶作用下水解成色，室溫下反應20,min，顏色反應的深淺與標本中相應抗原(抗體)的量成正比．

終止反應：在每孔中加入50,μL終止液，終止反應．

測定吸光度：在雙波長方式(450,nm為測定波長，650,nm為參考波長)下，用酶標儀測定吸光度(A).

計算不同濃度的速滅威對抗體與酶標抗原結合的抑制率．

以抑制率為縱坐標，速滅威標品質量濃度(ρ，單位為ng/mL)的對數為橫坐標繪制標準曲線，求出靈敏度即抑制終濃度(IC50)和最低檢出限(IC15)．

1.3 樣品的前處理

對6種樣品進行樣品基質影響和消除的研究，經檢測不含有速滅威農藥．加標實驗中，向各樣品中分別添加50、100、200,μg/kg的速滅威標準品，將加標樣品充分混勻，稱取1,g樣品，用10,mL有機溶劑提取，渦旋振蕩5,min后，5,000,r/min離心5,min，吸取上清液，過0.22,μm的有機膜．將上述過膜后的液體用PBS稀釋不同的倍數，并添加吐溫20或BSA 或明膠作為掩蔽劑，消除基質影響．

1.4 樣品的添加回收

所有樣品經島津高效液相色譜儀檢測，結果均為陰性. 在這些陰性樣品中分別添加50、100、200,μg/kg的速滅威標準品，每個水平作 3次平行實驗，添加后振蕩混勻，處理后進行直接競爭酶聯免疫檢測．

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

確定了速滅威直接競爭ELISA檢測中抗體包被濃度為每孔1.0,μg，酶標抗原稀釋度為1﹕8,000．標準品用PBS緩沖溶液從2,000,μg/L開始5倍梯度稀釋得到6個濃度，以直接競爭ELISA法，得到不同速滅威濃度的450～650,nm吸光度，根據吸光度值計算抑制率，繪出速滅威標準曲線，如圖1所示．本法測定的速滅威靈敏度IC50為(32.9±0.50)μg/L，檢測限為(2.5±0.09)μg/L．

圖1 速滅威直接競爭ELISA標準曲線Fig. 1 Standard curve of Metolcarb competitive direct ELISA

2.2 提取溶劑的選擇

提取是農藥殘留分析步驟中很關鍵的一步．提取溶劑的選擇與待測農藥性質、檢測方法及樣本種類有關[9]．根據“相似相溶”原理，應選擇與待測農藥極性相似的溶劑，并要求提取溶劑的沸點應為40～50,℃，既能溶解待測農藥，又不能與待測農藥發生反應．同時要考慮檢測器檢測時的要求[10]．為提高提取效率也可以使用兩種或兩種以上的混合溶劑提取，但這無疑增多了實驗步驟，對快速檢測方法無益．因此，在保證提取效率的前提下，最好選用單種有機溶劑提取．對含水量高的樣本，要選擇與水能相混溶的溶劑，還應考慮溶劑對樣本的滲透能力等，以便將樣本組織中的待測農藥充分提取出來[11]．在農藥殘留分析中，根據農藥極性、樣本性質等選擇不同極性的提取劑[12]，目前應用最廣泛的溶劑是甲醇或丙酮，它們能很好地溶解大多數農藥．但丙酮會大量提取植物組織中的油脂和色素[7,13]，對下一步的檢測帶來困難，并且會降低方法靈敏度．甲醇對氨基甲酸酯類農藥提取率較高、效果好，本實驗用甲醇作為提取溶劑.

2.3 基質影響的消除

酶聯免疫技術之所以能夠在快速檢測中得到發展，主要是因為酶聯免疫檢測方法檢測線靈敏，而且其前處理相對簡單．提取后只需經適度稀釋，必要的時候還需加合適的掩蔽劑(明膠、BSA、乳粉等)[14-15].中藥成分復雜，提取液中含有的色素、糖、植物蛋白、脂肪及提取溶劑等均能對抗原抗體的結合產生干擾，這種基質效應會降低標準曲線的靈敏度和方法的可靠性．本實驗發現，在稀釋的基礎上適當地加一些掩蔽劑即可以消除基質影響，使基質曲線與標準曲線重合．

以板藍根為例，將上清液在旋轉蒸發儀上蒸干后，用總體積為1,mL的不同比例甲醇和PBS復溶，過膜后再用PBS稀釋20、50、100、200、300倍，基質影響的消除結果如圖2所示．

圖2 不同稀釋倍數的板藍根樣品中基質影響的消除Fig. 2 Different dilution to remove the matrix effect of Radix Isatidis

由圖2可知，稀釋300倍后基質曲線和標準曲線基本重合．在稀釋300倍的基礎上，以0.1%BSA和0.05% 吐溫20作掩蔽劑，能達到很好的基質消除效果，如圖3所示．

圖3 速滅威直接競爭ELISA抑制率曲線與吸光度曲線(n＝10)Fig. 3 Inhibition ratio curve and absorbance curve of competitive direct ELISA Metolcarb(n＝10)

板藍根的基質與標準品的抑制率曲線和吸光度值曲線幾乎完全重合，基質影響基本消除．其他中藥同上述方法，金銀花、枸杞、人參、大青葉和元胡止痛片的稀釋倍數分別是200、100、300、400、400倍；其中金銀花、枸杞用0.5%的明膠和0.05%的吐溫，大青葉、人參用0.1%的BSA和0.05%的吐溫，元胡止痛片用0.3%的BSA和0.05%的吐溫分別作為掩蔽劑，可以使標準曲線和吸光度值曲線完全重合．由于沒有太多相關的限定標準，稀釋后的靈敏度仍能滿足檢測的要求．

2.4 添加回收實驗

在不同中藥樣品中分別添加不同含量的速滅威，用酶聯免疫法檢測計算回收率，每個水平作 3次平行實驗，結果見表1．由表1可知，直接競爭酶聯免疫法的回收率在64.00%～91.30%之間，變異系數小于30.12%．

表1 直接競爭ELISA添加回收實驗(n＝3)Tab. 1 Recovery test in ELISA(n=,3)

3 結 語

本研究建立了對中藥中速滅威殘留量的直接競爭酶聯免疫分析方法．該方法樣品處理簡單，只需經適度稀釋就能達到消除基質的目的，并且與國內及日本肯定列表規定的其他食品的限定標準相一致，靈敏度仍能滿足檢測要求．此法有開發成商品試劑盒的潛力．

［1］ 祝賀，宋愛華，田楊，等. GC-MS 法同時測定中藥材中29種農藥殘留量[J]. 沈陽藥科大學學報，2007，24(6)：342-343.

［2］ 趙燕燕，孫啟時. 中藥中重金屬和農藥殘留的研究[J].藥學實踐雜志，2000，18(5)：272-274.

［3］ 李艷霞. 中藥中有機農藥殘留量檢測方法的研究[D].南昌：南昌大學，2005.

［4］ 吳伯平. 德國中藥檢測標準[J]. 中國中醫藥信息雜志，1995，2(9)：38-39.

［5］ 李萍，王緒卿. 肉及蛋類食品中氨基甲酸酯類農藥多組分殘留高效液相色譜分析[J]. 衛生研究，2002，31(6)：466-468.

［6］ 向增旭，趙維佳，郭巧生. 金銀花中18種有機磷農藥殘留量分析方法的研究[J]. 中國中藥雜志，2006，31(16)：1321-1323.

［7］ 郭金生. 速滅威–辛硫磷乳油反相高效液相色譜法同柱分析[J]. 河北北方學院學報：自然科學版，1996，12(2)：36-38.

［8］ Sun J W，Dong T T，Zhang Y，et al. Development of enzyme linked immunoassay for the simultaneous detection of carbaryl and metolcarb in different agricultural products[J]. Analytica Chimica Acta，2010，666 (1/2)：76-82.

［9］ 薛健，金紅宇，田金改，等. 中藥農藥殘留問題研究與思考[J]. 中草藥，2007，38(10)：1578-1581.

［10］ 張艷. 農藥殘留分析中不同提取溶劑的評價[J]. 甘肅農業科技，2006(9)：28-29.

［11］ 馮秀瓊，湯慶勇. 中草藥中14種有機磷農藥殘留量同時測定：微波輔助提取法[J]. 農藥學學報，2001，3(3)：45-52.

［12］ 張奇. 速滅威等化學農藥免疫速測技術研究[D]. 南京：南京農業大學，2004.

［13］ 白青云，劉長武，買光熙，等. 化學衍生氣相色譜法測定速滅威在水稻組織中的殘留[J]. 農藥，1984(6)：38-39.

［14］ Sun J W，Liu B，Zhang Y，et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for metolcarb residue analysis and investigation of matrix effects from different agricultural products[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2009，394(8)：2223-2230.

［15］ Iijima M，Matsuzaki T，Kadoya H，et al. Bionanocapsulebased enzyme-antibody conjugates for enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Analytical Biochemistry，2010，396(2)：257–261.

責任編輯：郎婧

Metolcarb Residue Analysis Using ELISA in Chinese Herbal Medicines

ZHANG Shuguang，WANG Junping，SHENG Wei，ZHANG Yan，WANG Shuo
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

A direct competitive ELISA was established in detecting Metolcarb residues in Chinese herbal medicines，such as Lonicera chrysantha，Lycium chinense，Radix Ginseng，Radix Isatidis，Folium Isatidis and Yuanhu painkillers. After Lonicera chrysantha and so on were mashed and homogenized，methanolextraction, rotary steaming，and PBS were used to make up to volume. Moderate dilution then could eliminate the influence of matrix，which was detected by ELISA. In Chinese herbal medicines，the recovery rate was 66%-91%，with variation coefficient less than 30%. The method is simple，quick，sensitive and accurate in detecting the Metolcarb residues in Chinese herbal medicines.

ELISA；Chinese herbal medicines；Metolcarb；determination

R932

A

1672-6510(2012)03-0021-04

隨著中醫藥事業的發展，中醫藥在世界范圍內的防病和治病作用受到越來越多的關注，但中藥卻不為國際承認，主要原因在于中國的中藥及其制劑缺乏完備合理的質量控制標準，包括中藥及其制劑有效成分質與量的控制以及中藥材及其制劑中有毒、有害成分(雜質)的種類和量值控制[1]．而且野生藥材資源日漸枯竭，人們將許多中藥進行人工種植．在種植過程中為了提高產量而廣泛使用農藥，隨之帶來中藥材農藥殘留問題，使藥材質量受到影響[2]．

現有國內外對農產品及環境中化學農藥的殘留分析大多采用儀器分析法、生物測定和生化測定法[3–4]，我國目前進行農藥殘留檢測最常用的手段有高效液相色譜法(HPLC)[5–6]、氣相色譜法(GC)[7]、液–質聯用(HPLC/MS)和氣–質聯用(GC/MS)等[2].液相色譜法檢測多種農藥易出現某些待測組分因分離效果不佳而可能導致的定性困難的缺點，氣相色譜質譜法則成本較高[8]，而且儀器分析因其繁復的前處理使現場檢測受到限制．酶聯免疫學法檢測靈敏度高、重復性好、成本低廉、簡便快捷、樣品容量大、時間短．國內外用酶聯免疫學法或酶免技術與其他技術相結合的檢測方法檢測食品中的速滅威殘留的相關報道甚多，而對中藥材的檢測分析卻未有文獻報道．因此，本研究建立了直接競爭酶聯免疫法(ELISA)，測定金銀花、枸杞、人參、板藍根、大青葉和圓弧止痛片為代表的中藥中農藥速滅威的殘留量．

2011-12-25；

2012-03-13

國家科技重大專項課題(2009ZX09502-027)

張曙光（1986—），女，河北人，碩士研究生；通信作者：王 碩，教授，s.wang@tust.edu.cn.