從臨床肺炎死亡樹鼩中分離到致病性大腸埃希菌

高家紅，仝品芬，孫曉梅，江勤芳，代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118)

經驗交流

從臨床肺炎死亡樹鼩中分離到致病性大腸埃希菌

高家紅，仝品芬，孫曉梅，江勤芳，代解杰

(中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118)

目的 對6例1月內因肺炎死亡的樹鼩采樣進行病原菌分離培養鑒定分析。方法解剖死亡樹鼩，利用無菌刀片切開肺組織，用無菌接種環插入肺內采樣接種于營養瓊脂培養基，另取兩份樣品進行細菌涂片革蘭氏染色和抗酸染色。培養出來的細菌進行進一步分離和菌落生長情況的觀察，并經革蘭氏染色、抗酸染色、氧化酶試驗、生化編碼鑒定和9種藥敏試驗，初步確定樹鼩肺部感染的致病菌及其藥敏情況。結果樣本革蘭氏染色見到大量陰性桿菌，抗酸染色結果顯示為非結核分枝桿菌，大小約為0.2 μm×2～6 μm。營養瓊脂培養6例樣品中均僅見1株旺盛生長的細菌，進一步分離培養經革蘭氏染色為陰性桿菌，抗酸染色為非結核分枝桿菌，大小和染色結果與樣本涂片相同，經鑒定為致病性大腸埃希菌。藥敏試驗表明該菌對頭孢哌酮，呋喃妥因，氨芐西林，阿米卡星，氧氟沙星，諾氟沙星，磺胺甲噁唑/甲氧芐定高度敏感;對慶大霉素和青霉素G為低度敏感。結論6例樹鼩死亡原因均為細菌性肺炎，病原菌初步鑒定為致病性大腸埃希菌。藥敏實驗篩選出的藥物可為臨床治療樹鼩該類病例用藥提供指導。

樹鼩;致病性大腸埃希菌;藥敏試驗

樹鼩(Tupaia belangeri chinensis，tree shrew)是一種在生物醫學研究中很有價值的新型實驗動物，近幾十年來，樹鼩已廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲、神經、內分泌、泌尿、腫瘤等方面的研究［1］。

人工飼養狀態下群養或交配飼養的成年樹鼩常常因飼養條件不適、營養、發情等原因撕咬致傷致殘，繼而導致突然死亡。該類死亡樹鼩常可見到明顯的外傷，無腹瀉癥狀，極易判斷死因。單獨關養的成年樹鼩無任何外觀表現異常而突然死亡的原因應進行調查分析，引起足夠的重視。

本文對我中心6例單獨關養的樹鼩急性死亡病例進行解剖診斷，確診為肺炎后用細菌學方法采樣進行了培養、分離、鑒定和藥敏試驗，弄清了導致死亡的原因。

1 材料和方法

1.1 培養基和主要試劑

營養瓊脂、S．S．瓊脂、三糖鐵培養基、腸桿菌科細菌生化鑒定管、氧化酶試驗試劑盒、革蘭氏染色試劑盒均購自杭州天和微生物試劑有限公司，快速抗酸染色試劑盒購自邁克生物試劑有限公司，藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術公司產品。

1.2 樹鼩細菌采樣涂片和培養

人工飼養的6只成年樹鼩，均來自于中國醫學科學院醫學生物學研究所靈長類研究中心【SCXK (滇)2010－0003】【SYXK(滇)2010－0007】，單獨飼養于室內不銹鋼籠。平時飼喂由玉米粉、麥粉、奶粉、白糖、雞蛋等配合經蒸熟成糕狀的食物，輔食以飼喂蘋果、面包蟲為主。每日清潔一次飲水盒及料盒并清掃糞便。樹鼩發病前飲食活動均正常，發病后活動性下降，通常厭食1 d后絕食，次日死亡。尸體解剖見外觀無異常，肛周清潔無腹瀉癥狀，剖見心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎臟、腎上腺、膀胱均正常，胃、大腸、小腸空無，雙肺表面呈眾多白色針尖樣細小結節，全肺充血浸潤，急性肺炎典型癥狀明顯。利用無菌刀片切開肺部結節部位，用無菌接種環插入肺內病灶采樣接種于營養瓊脂培養基，將平皿倒置放入37℃恒溫培養箱中培養18～24 h觀察結果。另采樣兩份于預先滴有1滴生理鹽水的潔凈載玻片上進行細菌涂片革蘭氏染色和抗酸染色鏡檢。

1.3 細菌分離培養和染色

挑選營養瓊脂培養皿中的典型菌落用三糖鐵瓊脂鑒別培養基作進一步的分離培養和產酸產氣等培養特征鑒定。挑選分離培養得到的單個菌落涂片按革蘭氏染色試劑盒和快速抗酸染色試劑盒使用說明書分別進行革蘭氏染色和抗酸染色鏡檢。另外轉種S．S．瓊脂觀察培養特性。

1.4 氧化酶試驗

將潔凈濾紙條置于干凈平皿內，在超潔凈操作臺中用接種環在分離培養的中管里輕刮一滿環菌體均勻涂于濕潤的濾紙上，用氧化酶試劑滴在濾紙條細菌培養物上，10 s內觀察結果。紫紅色為陽性，無色或淡黃色為陰性(觀察結果不明顯時需進行重復實驗)。

1.5 細菌生化鑒定

取生化編碼鑒定管用砂輪將玻璃管上端劃痕折斷，然后用接種針取分離到的純菌培養物接種(氨基酸及對照管需覆蓋滅菌液體石蠟1～2滴)，置滅菌平皿內或小試管架上放35℃培養箱內，18～24 h內觀察生化反應結果。對照采用大腸埃希菌ATCC25922。

15種腸道桿菌生化編碼鑒定管為:硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉子糖、山梨醇、側金盞花醇、木膠糖。

1.6 藥敏試驗

采用K-B紙片法進行［2］，本次所用藥敏試紙片如下:阿米卡星(AN30 μg/片)、青霉素G(P10 μg/片)、頭孢哌酮(CFP75 μg/片)、氨芐西林(AM10 μg/片)、呋喃妥因(FT300 μg/片)。慶大霉素(GM10 μg/片)、諾氟沙星(NOR10 μg/片)、氧氟沙星(OFL5 μg/片)、磺胺甲噁唑/甲氧芐定(SXT 23.75/125 μg/片)。對 照 采 用 大 腸 埃 希 菌ATCC25922。

表1 樹鼩肺炎病原菌藥敏試驗結果Tab．1 Susceptibility test results of pneumonia pathogenic bacterium in tree shrew

2 結果

2.1 樣品及其培養分離物革蘭氏染色

樣品及培養物涂片革蘭氏染色在油鏡下均見到大量桿狀紅色細菌，形態幾乎完全相同，為革蘭氏陰性桿菌，未見其它細菌(彩插4圖1)。

2.2 樣品及其培養分離物抗酸染色

油鏡下樣品及培養物涂片抗酸染色均見到大量細長桿狀藍色細菌，無彎曲和分枝，抗酸染色為陰性，證實該菌為非結核分枝桿菌(彩插4圖2)。

2.3 細菌培養分離和鑒定

營養瓊脂培養6例樹鼩均僅見1株細菌生長，無其它細菌，該菌生長旺盛，菌落呈圓形凸起，半透明，表面光滑濕潤，37℃培養18 h菌落直徑大小約0.5 cm。三糖鐵培養基分離培養產酸產氣，得到的細菌革蘭氏染色為陰性桿菌，氧化酶試驗均為陰性，抗酸染色為非結核分枝桿菌，大小約為0.2 μm ×2～6 μm，接種 S．S．瓊脂生長迅速，粉紅色菌落，呈云霧狀，經細菌生化編碼鑒定為致病性大腸埃希菌，符合率為100%。

2.4 細菌藥敏試驗

細菌藥敏試驗測得的抑菌圈大小見表1。從表中可看出該菌對所試藥物均敏感，其中對頭孢哌酮，呋喃妥因，氨芐西林，阿米卡星，氧氟沙星，諾氟沙星，磺胺甲噁唑/甲氧芐定高度敏感，對慶大霉素，青霉素G為低度敏感。

3 討論

大腸埃希菌通常情況下對人體無害，但也有部分致病性發生改變了的大腸埃希菌特殊血清型，可以導致消化道感染［3］。在人類，大腸埃希菌引起細菌性肺炎感染的人群主要是新生兒、老年人和體弱多病者，其他人群較少見，且預后惡劣［4，5］。在實驗動物中，引起肺炎的致病細菌眾多，但少見致病性大腸埃希菌感染的報道。一般情況下成年樹鼩的死亡以咬死和腹瀉較為常見，肺炎相對少見。雖然我們從臨床肺炎死亡的樹鼩新鮮尸體肺臟分離到致病性大腸埃希菌，但同時潛在的聯合致病因子或其他病原尚未針對性分離或排除，因此分離到的致病性大腸埃希菌盡管從癥狀表現上看很有可能是樹鼩致病致死的主要原因，但不一定是致病致死的唯一原因。盡管如此，值得重視的是本文病例的發生說明大腸埃希菌有可能導致成年樹鼩急性細菌性肺炎而死亡。

本文病例分離培養檢出的病原菌為致病性大腸埃希菌，該菌很容易通過飲食、環境接觸而感染，而且只要生長條件適宜，繁殖十分迅猛。因此，我們日常飼養管理中應當注意樹鼩巢箱、飲食的衛生、活動性和排便數量性狀的觀察記錄，重視氣溫快速變化時采取及時保暖措施提高機體抗病能力。一旦存在病例發生，應引起足夠重視，及時隔離治療，加強飲食衛生，有效進行環境消毒，以防止在群體間迅速傳播。

實驗室內樹鼩爆發間質性肺炎已有報告，特點是發病急，死亡率高，其病原為肺炎支原體［6］。但其他類型的樹鼩肺炎少有報道。由于在解剖中見到白色針尖狀結節，因此我們懷疑有結核分枝桿菌的可能性，故而進行了抗酸染色進行鑒別，結果證明為非結核分枝桿菌。但對形成細小結節的原因尚不明確，由于直接涂片中都見到大量細菌，推測可能為細菌大量集聚所致。

本次藥敏試驗表明，導致樹鼩死亡的菌株對所試藥物均敏感，這為以后早期發現病例的治療提供了實驗依據和藥物選擇上的便利。

［1］ 秦雪，伊瑤，畢勝利，等．樹鼩應用于疾病動物模型的研究進展［J］．中華實驗和臨床病毒學雜志，2006，20(2):97－98．

［2］ 孔繁林編．實用臨床細菌鑒定，第一版，昆明:云南科技出版社，1997，64．

［3］ 趙鎧，章以浩，李河民主編．2007．醫學生物制品學，2版．北京:人民衛生出版社，1016－1024．

［4］ 胡小平．老年人肺炎的臨床特點及治療(附55例報告)［J］．贛南醫學院學報，2009，29(4):579－580．

［5］ 彭啟燦，盧文賽，熊英，等．肺部革蘭氏陰性菌感染的診斷和治療［J］．瀘州醫學院學報，1990，13(3):217－219

［6］ 李媛，楊春，蘇建家，等．實驗室內樹鼩爆發間質性肺炎的報告［J］．四川動物，2005，01:21－24．

Isolating Enteropathogenic E．coli from Clinical Pneumonia in Dead Tree Shrews

GAO Jia-hong，TONG Pin-feng，SUN Xiao-mei，JIANG Qin-fang，DAI Jie-jie (Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medicine Sciences(CAMS)＆Peking Union Medical College(PUMC)，
Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research＆Development on Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China)

ObjectiveTo isolate，culture and identify the pathogenic bacterium from 6 cases of bacterial pneumonia within 1 month in tree shrews．Methods We Dissected the dead tree shrew，cut open the lung tissue with sterile blade to insert focus of infection in the lung with inoculating loop to get samples for inoculating on nutrient agar and another two samples for bacterial smear with Gram staining and acid-fast staining．The bacterium obtained was isolated and cultivated for bacterial growth observation，then the pathogenic bacterium of tree shrew and its antibiotic susceptibilities was initially identified by Gram staining，acid-fast staining，oxidase test，biochemistrical encoding identification system and 9-kind antibiotic susceptibility test．Results A amount of negative bacteria were observed from samples with Gram staining．Acid-fast staining appears it was nontuberculous mycobacterium about size 0.2 μm ×2～6 μm．Only 1 strain strong bacterium was observed in every 6 case on nutrient agar plate，it was verified as Gram-negative bacterium and nontuberculous mycobacterium，its size and staining results were the same as samples．It was identified as enteropathogenicE．coli．Antibiotic susceptibility test shows it is highly susceptibility to cefoperazone，furantoin，ampicillin，amikacin，ofloxacin，norfloxacin，sulfonamide methoxybenzyldine and low susceptibility to gentamicin and penicilin．Conclusion We conclude that Bacterial pneumonia is the cause of these 6 tree shrew death cases，the enteropathogenic E．coli．was initially identified as the reason．Drugs selected by antibiotic susceptibility could instruct clinical treatment like these cases in tree shrews．

Tree shrew(tupaia belangeri chinensis);Enteropathogenic E．coli;Antibiotic susceptibility test

R332

A

1671-7856(2012)09-0081-03

10.3969．j．issn．1671.7856.2012.009.018

2012-08-23

“十一五”國家科技支撐計劃項目 (2009BAI83B02、2011BAI15B01)。云南省科技基礎條件平臺建設計劃項目(2006PT07-2)。

高家紅(1968－)，男，碩士，助理研究員，研究方向:實驗動物學。Email:gjh@imbcams．com．cn。

代解杰(1961－)，男，研究員。E-mail:djj@imbcams．com．cn。