TGF-β1和ADAM33基因交互作用與兒童哮喘易感性及嚴(yán)重程度相關(guān)性①

李宏彬 徐光翠 桂立輝 馮憲軍 趙 兵 席景磚 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)系，新鄉(xiāng)453003)

哮喘是兒童最常見的一種慢性呼吸道炎性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制涉及到機(jī)體免疫、遺傳、神經(jīng)和環(huán)境等諸多方面［1］。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在引起哮喘的眾多因素中，遺傳可能是最為重要的因素。TGF-β1基因是一種具有多功能生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝、參與炎性反應(yīng)、間質(zhì)纖維化和抑制免疫監(jiān)視等方面起重要作用［2，3］。分子生物學(xué)研究表明，TGF-β1基因存在多個基因多態(tài)性位點(diǎn)參與哮喘的發(fā)生，但確切機(jī)制尚不明了［4］。ADAM33是首個通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因［5］，位于人類染色體 20p13，至少包含70個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，研究表明該基因具有高度多態(tài)性，在不同的種族，與哮喘的發(fā)生以及氣道高反應(yīng)性有顯著相關(guān)［6］。目前有關(guān)TGF-β1和ADAM33基因交互作用與漢族兒童哮喘易感性研究尚少見文獻(xiàn)報道。本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照方法，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性，檢測對照組和病例組兒童TGF-β1基因T869C位點(diǎn)和 ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，從遺傳流行病學(xué)角度探討兩基因的單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphisms，SNPs)與漢族兒童哮喘易感性及嚴(yán)重程度的關(guān)系，為篩選哮喘的高危人群提供分子流行病學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2008年3月至2010年10月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科和兒科住院及門診患兒110例，男61例，女49例，年齡3.1～14.6歲，符合全球哮喘防治創(chuàng)議的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，其中輕中度哮喘63例和重度哮喘47例。同時選擇同期住院非呼吸系統(tǒng)疾病患者144例為對照組，對照均無個人及家族哮喘史和過敏史(包括濕疹、過敏性鼻炎、過敏性皮炎)。病例組和對照組間性別構(gòu)成和平均年齡均無差異，所有研究對象均為來自豫北地區(qū)(河南省黃河以北5市)的漢族兒童，并由家長或監(jiān)護(hù)人簽署《知情同意書》。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝管采集受檢者外周靜脈血2 ml放置-80℃冰箱備用。DNA提取試劑盒購自上海生物工程有限公司，所有操作步驟均按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因型檢測 通過GenBank查找到編號為rs1982073、rs2787094和rs2280090基因完整序列，采用 Primer premier 5軟件包設(shè)計 TGF-β1基因T869C位點(diǎn)和ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)引物，設(shè)計的引物由上海生物工程有限公司合成。三位點(diǎn)的引物及PCR反應(yīng)退火溫度、產(chǎn)物長度及酶切片段見表1。PCR 反應(yīng)總體積 25 μl，其中 10 × Buffer 2.5 μl，TaqDNA 聚合酶 0.7 U，dNTP 2.5 μl，上下游引物各1 μl，Template DNA 1.5 μl，25 mmol/L MgCl21.8 μl，雙蒸水14 μl;PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5分鐘;95℃變性30秒，一定的退火溫度30秒，72℃延伸40秒，共35個循環(huán);72℃終延伸10分鐘，最后4℃保存。取10 μl PCR產(chǎn)物，建立總體積為30 μl的酶切反應(yīng)體系，加入相應(yīng)的限制性酶 Pst I、Hinf I和PvuⅡ(fermentas基因公司)，37℃溫育4小時，65℃水浴15分鐘終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0.5 μg/ml)電泳分離，經(jīng)凝膠成像儀系統(tǒng)處理后進(jìn)行基因型判讀，記錄并保存結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行統(tǒng)計分析。為考察研究資料的可靠性，所有位點(diǎn)每組分別進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。組間基因型頻率和等位基因頻率的差異性比較采用χ2檢驗。基因多態(tài)性與哮喘患病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)程度采用比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)描述。采用MDR(version 1.1.0)軟件分析SNP間交互作用。檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本的Hardy-Weinberg平衡檢驗 三位點(diǎn)在各組的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明本次抽樣具有代表性。TGF-β1基因T869C位點(diǎn)對照組(χ2=0.033，P=0.402)，病例組(χ2=1.584，P=0.856);ADAM33基因 V4位點(diǎn)對照組(χ2=0.823，P=0.396)，病例組(χ2=0．036，P=0.849);T2位點(diǎn)對照組(χ2=0．703，P=0.402)，病例組(χ2=1．584，P=0.208)。

2.2 TGF-β1和ADAM33基因多態(tài)性位點(diǎn)與兒童哮喘相關(guān)性分析 由表2可見，T869C多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在哮喘各組與對照組之間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘各組中V4位點(diǎn)C等位基因頻率均高于對照組(P＜0.01)，C等位基因攜帶者患哮喘的危險性是G等位基因的2.36倍(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56)，T2位點(diǎn) A 等位基因頻率在哮喘各組中的分布均高于對照組(P＜0.01)，A等位基因攜帶者患哮喘的危險性是G等位基因的2.96倍(OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。V4位點(diǎn)CC基因型分布在對照組與輕中度哮喘組無差異外，余在各組中分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);T2位點(diǎn)除GA基因型分布在對照組與輕中度哮喘組、AA基因型分布在對照組與重度哮喘組無差異外(P=0.084、0.063)，其余在各組中分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 候選多態(tài)性位點(diǎn)的引物、PCR產(chǎn)物長度及酶切片段Tab．1 Candidate polymorphisms，polymerase chain reaction(PCR)，Annealing temperature，PCR product sizes，restriction enzymes and digested fragment size

2.3 多態(tài)性位點(diǎn)之間的MDR交互作用分析 將數(shù)據(jù)進(jìn)行交互作用分析，目的在于找出與兒童哮喘發(fā)病顯著相關(guān)的基因與基因的交互作用，在一至三階模型中發(fā)現(xiàn)2個位點(diǎn)最佳模型僅包含ADAM33基因位點(diǎn)V4和T2;3個位點(diǎn)最佳模型包括了T869C、V4和T2。兩模型哮喘組和對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，交叉驗證一致率均為100%。見表3，模型的單元格劃分及組合情況見圖1。

表2 ADAM33和TGF-β1基因型及等位基因頻率在對照組與哮喘組、不同程度哮喘組的分布Tab．2 Distribution of genotype and allele frequencies for ADAM33 and TGF-β1 between controls(CTR)and total patients with asthma(TA)，patients with moderate asthma(MA)，and patients with severe asthma(SA)

表3 ADAM33和TGF-β1基因交互作用的MDR模型Tab．3 MDR models of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

圖1 ADAM33和TGF-β1基因多態(tài)性位點(diǎn)交互作用的圖解模型Fig．1 Graphical representation of the interaction between ADAM33 and TGF-β1 gene SNPs

3 討論

ADAM33是2002年首個通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因，因其與支氣管哮喘密切相關(guān)而成為近年來的研究熱點(diǎn)。先后多個研究小組對不同種族人群ADAM33基因單核酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，而研究結(jié)果不盡一致，Qu等［8］研究表明 ADAM33基因的T+1、T1、V4可能參與了中國北方漢族兒童哮喘的發(fā)病過程。Nallur等［9］則在印第安人群進(jìn)行的一個病例對照研究中沒有發(fā)現(xiàn)ADAM33基因多態(tài)性與兒童哮喘存在相關(guān)性。基于哮喘在具有不同遺傳背景的人群中可能存在不同的哮喘易感基因與各種環(huán)境因素作用而導(dǎo)致哮喘發(fā)生，本研究選擇ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)探討中國豫北地區(qū)漢族兒童該基因多態(tài)性和哮喘病的關(guān)系。

本組資料結(jié)果顯示，哮喘組ADAM33基因V4位點(diǎn)C等位基因和T2位點(diǎn)A等位基因頻率顯著高于對照組，提示C、A等位基因可能增加兒童哮喘的發(fā)病風(fēng)險(OR=2.36，95%CI=1.56～3.56;OR=2.96，95%CI=1.78～4.94)。將哮喘患兒分為輕中度和重度對照研究發(fā)現(xiàn)，重度哮喘組V4位點(diǎn)CC基因型頻率高于對照組，輕中度和重度哮喘組GC基因型頻率高于對照組，表明C等位基因可能同時影響兒童哮喘發(fā)病嚴(yán)重程度，當(dāng)然也有學(xué)者得出不同的結(jié)論［10］，究其原因可能與種族、樣本量大小及環(huán)境暴露因素有關(guān)。結(jié)果還顯示T2位點(diǎn)GA基因型僅與重度哮喘有關(guān)，AA基因型僅與輕中度哮喘有關(guān)，而GG基因型可能使哮喘的發(fā)病風(fēng)險降低，這與Jie等［11］的研究相一致。本資料提示V4、T2位點(diǎn)多態(tài)性不僅與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生有關(guān)而且影響哮喘嚴(yán)重程度。

TGF-β1基因T869C位點(diǎn)C置換T后導(dǎo)致蛋白質(zhì)第10號位置的氨基酸由亮氨酸(Leu)變成脯氨酸(Pro)，進(jìn)而影響到TGF-β1的分泌和表達(dá)。文獻(xiàn)資料顯示，TGF-β1能調(diào)節(jié)氣道炎癥和加速氣道重塑，增加氣道阻力，影響哮喘發(fā)病過程［12］。也有研究得出相反的結(jié)論，Wisniewski等［13］就未發(fā)現(xiàn)T869C與波蘭人哮喘病的發(fā)生有關(guān)。本組資料顯示T869C位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在哮喘各組與對照組間均無差異，這表明該多態(tài)性位點(diǎn)與豫北地區(qū)漢族兒童哮喘的發(fā)生及其嚴(yán)重程度無明顯相關(guān)性。

基因-基因交互作用分析是目前遺傳流行病學(xué)研究的熱點(diǎn)問題之一，MDR方法作為一種非參數(shù)、不受遺傳模式影響的分析方法，被成功用于分析多因素相關(guān)的復(fù)雜疾病研究。雖然 TGF-β1基因T869C位點(diǎn)基因型在哮喘組和對照組之間分布無差異，經(jīng)過MDR分析提示，ADAM33基因V4、T2位點(diǎn)與TGF-β1位點(diǎn) T869C具有明顯交互作用，推測V4、T2、T869C三位點(diǎn)對哮喘發(fā)病可能具有累計效應(yīng)。哮喘是一種多基因遺傳疾病，發(fā)病機(jī)制涉及多條生化通路，單個基因或位點(diǎn)在其發(fā)病中的作用難以得到證實，同時針對多基因多位點(diǎn)的研究可能更具有意義。

1 Cookson W.The alliance of genes and environment in asthma and allergy［J］.Nature，1999;402(6760 Suppl):B5-B11.

2 Wan Y Y，F(xiàn)lavell R A.‘Yin-Yang'functions of transforming growth factor-βand T regulatory cells in immune regulation ［J］.Immunol Rev，2007;220:199-213.

3 Rosenbloom J，Jimenez S A.Molecular ablation of transforming growth factorβ signalling pathways by tyrosine kinase inhibition:the coming of a promising newera in the treatment of tissue fi brosis［J］.Arthritis Rheum，2008;58(8):2219-2224.

4 Li H，Romieu I，Wu H et al.Genetic polymorphisms in transforming growthfactor beta-1(TGF-β1)and childhood asthma and atopy［J］.Hum Genet，2007;121(5):529-538.

5 Van Eerdewegh P，Little R D，Dupuis J et al.Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness［J］.Nature，2002;418(6896):426-430.

6 Howard T D，Postma D S，Jongepier H.Association of a disintegrin and metalloprotease 33(ADAM33)gene with asthma in ethnically diverse populations［J］.J Allergy Clin Immunol，2003;112(4):717-722.

7 Bateman E D，Hurd S S，Barnes P J et al.Global strategy for asthma management and prevention:GINA executive summary［J］.Eur Respir J，2008;31(1):143-178.

8 Qu S，Sun D，Wang Y et al.Association of ADAM33 polymorphisms with childhood asthma in a northern Chinese population［J］.Experimental and Molecular Pathology，2011;91:775-779.

9 Nallur M B，Mahesh R，Pradeep S M et al.Association of IL-4 and ADAM33 gene polymorphisms with asthma in an Indian population［J］.Lung，2010;188:415-422.

10 Thongngarm T，Jameekornrak A，Limwongse C et al.Association between ADAM33 polymorphisms and asthma in a Thai population［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，2008;26:205-211.

11 Jie Z，Hu Z，Bai et al.ADAM33 gene polymorphisms associate with asthma susceptibility and severity in east China Han Population［J］.J Asthma，2011;48(10):979-985.

12 Mak J C，Leung H C，Ho S P et al.Analysis of TGF-β1 gene polymorphisms in Hong kong Chinese patient s with asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2006;117(1):92-96.

13 Wisniewski A，Obojski A，Pawlik A et al.Polymorphism of the TGFB1 gene is not associated with bronchial allergic asthma in a Polish population［J］.Hum Immunol，2009;70(2):134-138.