DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ基因蛋白表達水平與宮頸病變病理進程的相關性

古麗夏西·莫合衣提江 阿比達·阿布都卡德爾 阿布力孜·阿布杜拉 丁 巖

(新疆醫科大學第一附屬醫院婦科，新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌主要致病原因包括高危型人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，但多數HPV感染者并未發展為宮頸癌，這說明尚有其他分子事件或遺傳事件參與其發生。從分子生物學角度說，宮頸癌發生發展是個多基因參與的過程，從不同角度聯合檢測觀察多個腫瘤相關基因變化及其引起的生物學特征改變，對于闡明和補充其發病機制及找到能反映宮頸病變嚴重程度的生物指標具有重大意義。本文從蛋白質水平觀察死亡相關蛋白激酶(DAPK1)、人類白細胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)、雌激素受體(ER)α基因與宮頸病變病理進程的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2006～2008年我院病理科存檔的中老年漢族婦女子宮頸活檢及手術切除的宮頸癌及宮頸病變患者石蠟標本115例，包括宮頸炎/CINⅠ41例，CINⅡ/Ⅲ49例，宮頸癌25例，標本由10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，標本采集前均未經任何放療、化療、免疫治療，年齡24～60(平均42)歲。均經本院病理科有經驗的副主任醫師反復閱片后重新明確診斷。

1.2 主要試劑及儀器 主要試劑及儀器有 DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特異性抗體(購于美國Santa Cruz公司);免疫組織化學SP方法試劑、酶標二抗(北京中杉金橋生物技術公司)，另有光學顯微鏡(BA210，Motic)。

1.3 免疫組織化學方法 采用免疫組織化學SP法。首先取石蠟包埋組織，制作成厚度為4 μm組織切片，然后脫蠟、水化和加熱法(微波)抗原修復。再以H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，滴加稀釋過的相應的DAPK1、ERα、HLA-Ⅰ等特異性抗體(一抗)，4℃過夜。第二天，滴加1∶2稀釋的SP標記二抗(山羊抗兔，辣根過氧化物酶標記)，在37℃孵育1 h后依次加入DAB和蘇木精顯色，并常規脫水和透明封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學結果判定 細胞膜或細胞質或細胞核內出現棕黃色顆粒判定為陽性。細胞染色百分率以以下標準判定:在顯微鏡下觀察，記錄各切片染色細胞百分比，染色細胞數＜5%為0分，5%≤染色細胞數≤25%1分，26%≤染色細胞數≤75%2分，染色細胞數＞75%3分。染色強度判定標準:不顯色或顯色不清0分，淺黃色1分，棕黃色2分，深棕色3分。綜合積分按公式計算:綜合積分=(染色細胞分數+染色強度分數)/2;綜合判定:積分 ＜0.5分為“－”(缺失)，0.5分≤積分≤1.5分為“+”(不完全表達)，積分＞1.6分為“”(完全表達)。

1.5 統計學分析 采用SPSS16.0統計軟件進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 DAPK-1蛋白表達與宮頸病變病理進程的關系 DAPK-1蛋白陽性表達主要分布在上皮細胞質，著色呈淺黃到棕黃色，DAPK-1蛋白陽性表達率在CINⅡ/Ⅲ和宮頸癌中明顯降低，且DAPK1陽性表達率在宮頸癌組和CINⅡ/Ⅲ組中明顯低于宮頸炎/CINⅠ組(P均＜0.05)，宮頸癌組DAPK-1陽性表達率低于CINⅡ/Ⅲ組，但差異不顯著(P均＞0.05)。見表1，圖1。

2.2 ERα蛋白表達與宮頸病變病理進程的關系 不同宮頸病變組織免疫組化染色結果顯示ERα蛋白表達主要分布在細胞核、宮頸上皮細胞、幾乎所有的宮頸間質細胞、炎細胞中。宮頸炎/CINⅠ組與CINⅡ/Ⅲ組和宮頸癌組比較兩者之間差異顯著(P均＜0.05)，但CINⅡ/Ⅲ組與宮頸鱗癌中陽性表達率比較，差異不顯著(P＞0.05)。見表2，圖2。

表1 不同宮頸病變中DAPK1表達情況〔n(%)〕

圖1 DAPK1蛋白在不同宮頸病變組織中的表達(×400)

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表達與宮頸癌及癌前病變相關性 HLA-Ⅰ蛋白陽性表達主要定位于上皮細胞膜上，細胞膜著色呈淺黃到棕褐色。CINⅡ/Ⅲ上皮內HLA-Ⅰ表達明顯降低，宮頸癌內表達最低，不同病理級別宮頸病變中HLA-Ⅰ蛋白質表達水平差異顯著(P均＜0.05)，在宮頸病變中HLA-Ⅰ基因蛋白質表達隨著宮頸病變病理變化加重而遞減。見表3，圖3。

表2 不同宮頸病變中ERα的表達情況〔n(%)〕

圖2 ERα蛋白在不同宮頸病變組織中的表達(×400)

表3 不同宮頸病變中HLA-Ⅰ表達情況〔n(%)〕

圖3 HLA-1蛋白在不同宮頸病變組織內的表達(×400)

3 討論

高危型HPV感染被認為是宮頸癌發生發展中必需的主要致病原因，但宮頸癌的發病機制尚不清楚。宮頸癌發生發展是多基因、多因素共同作用的復雜過程。癌基因的激活、抑癌基因的失活是導致腫瘤發生的最重要分子生物學基礎。

DAPK是一種160 kU的鈣調蛋白(CaM)調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是凋亡的正性調節因子，而凋亡與腫瘤發生、發展、轉移密切相關〔1〕。DAPK1是已確認的抑癌基因，以往研究表明DAPK1基因在多種腫瘤細胞及腫瘤細胞系中失活，主要機制是由于異常的DNA甲基化修飾，從而使抑癌基因表達沉默，促使細胞惡性轉化〔2，3〕。Yang 等〔4〕對 85 例宮頸癌手術樣本及40例預處理的血漿樣本采用甲基化特異聚合酶鏈反應(MSP)對于DAPK基因行甲基化分析檢測，發現60%手術樣本和40%血漿樣本發生DAPK甲基化，異常甲基化宮頸癌組織及血漿中DAPK表達明顯減少甚至缺失。本研究結果提示DAPK1缺失可能是CIN和宮頸癌發生發展的重要分子生物學基礎。

宮頸癌發生、發展過程中免疫監視系統可能起重要作用。HLA系統是免疫系統中重要組成部分，腫瘤分子免疫學已證實了HLA-Ⅰ類分子在腫瘤免疫中處于重要的地位。1977年人類腫瘤細胞HLA分子缺失首次被發現，到目前為止人們已發現多種腫瘤細胞存在HLA分子缺失。研究證實HLA-Ⅰ類抗原在宮頸癌中常表達缺失，且部分HLA-Ⅰ類抗原表達缺失與5年生存率有顯著關聯〔5〕。本研究結果提示，可能由于HLA-Ⅰ蛋白在CINⅢ病變中表達明顯減少，從而腫瘤得以發生、發展。HLA-1蛋白減少使得細胞毒性T細胞無法發揮其特異性殺傷靶細胞的作用，出現了免疫逃逸現象即HPV感染后所致的異型細胞及腫瘤細胞避開了免疫系統的監視作用導致了腫瘤發生發展。由此可見，HLA-Ⅰ抗原對于阻止CIN及宮頸癌的發生、發展及改善可能起重要作用。

ER是類固醇受體超家族中的一員，位于細胞核內，是雌激素調節的轉錄因子，分為ERα和ERβ兩種亞型。ER在婦科腫瘤發生中可能起重要作用。ER及其功能途徑受到多重調控，其通過自身磷酸化，或與不同生長因子、共調節因子、癌基因或抑癌基因蛋白結合或相互作用，從而調節靶細胞生長分化。Nonogaki等〔6〕發現ERα在宮頸正常組織中表達率較非典型增生及宮頸癌組織中高。研究報道〔7〕，無論是正常宮頸組織，還是CIN鱗狀上皮和浸潤性宮頸鱗癌組織ER表達情況不同，HPV感染型別亦不同。在ERα陰性宮頸組織中，HPV16、18型感染更多見;而ERα陽性宮頸組織，多為HPV31、33、35型等感染。這些研究結果說明ERα表達缺失可能是HPVl6/18致宮頸癌機制中不可缺少的環節。研究發現ERα過度甲基化與宮頸癌發病的關系，并認為ERα可能是抑癌基因，且與其他甲基化敏感基因聯合檢測，可大大提高腫瘤檢出率〔8〕。ERα異常甲基化必然導致其轉錄水平變化，從而導致蛋白質表達降低或缺陷，但闡述宮頸病理進程與ERα基因表達水平變化關系文獻并不多。本研究結果與以往文獻報道一致〔9〕。ERα核表達下調或缺失可能是宮頸鱗癌發生的重要機制。ERα蛋白在宮頸病變組織中的表達水平在一定程度上對預測宮頸病變嚴重程度有幫助。

總之，DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表達水平均隨著宮頸病變病理變化的加重而降低，這些基因表達缺失可能是CIN及宮頸鱗癌的重要生物學特征，有望作為預測宮頸癌前病變及宮頸癌的早期預警指標，另外DAPK1、HLA-Ⅰ、ERα等基因蛋白表達也有可能成為宮頸癌基因治療中有效的新的靶基因，本研究為宮頸癌前病變及宮頸癌基因甲基化等機制研究提供了重要基礎和候選基因。

1 Anjum R，Roux PP，Ballif BA，et al.The tumor suppressor DAP kinase is a target of RSK-mediated survival signaling〔J〕.Curr Biol，2005;15(19):1762-7.

2 Levy D，Pluzbureau G，Decroix Y，et al.Death associated protein kinase loss of expression is a new marker for breast cancer prognosis clinical〔J〕.Cancer Res，2004;10(9):3124-30.

3 Kuester D，Dar AA，Moskaluk CC，et al.Early involvement of death-associated protein kinase promoter hypermethylation in the carcinogenesis of Barrett's esophageal adenocarcinoma and its association with clinical progression〔J〕.Neoplasia，2007;9(3):236-45.

4 Yang HJ，Liu VW，Wang Y，et al.Detection of hypermethylated genes in tumor and plasma of cervical cancer patients〔J〕.Gynecol Oncol，2004;93(2):435-40.

5 Mehta AM，Jordanova ES，Kenter GG，et al.Association of antigen processing machinery and HLA classⅠdefects with clinicopathological outcome in cervical carcinoma〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2008;57(2):197-206.

6 Nonogaki H，Fujii S，Konishi I，et al.Estrogen receptor localization in normal and neoplastic epithelium of the uterine cervix〔J〕.Cancer，1990;66(12):2620-7.

7 Shew ML，McGlennen R，Zaidi N，et al.Oestrogen receptor transcripts associated with cervical human papillomavirus infection〔J〕.Sex Transm Infect，2002;78(3):210-4.

8 Wisman GA，Nijhuis ER，Hoque MO，et al.Assessment of gene promoter hypermethylation for detection of cervical neoplasia〔J〕.Int J Cancer，2006;119:1908-14.

9 Fonseca-Moutinho JA，Cruz E，Carvalho L，et al.Estrogen receptor，progesterone receptor，and bcl-2 are markers with prognostic significance in CIN Ⅲ〔J〕.Int J Gynecol Cancer，2004;14(5):911-20.