SU11248對白血病細胞HL-60增殖及凋亡作用的實驗研究①

陳惠瑜 施騰飛 成 玲 林東紅 羅玲清 胡建達

(福建省婦幼保健院檢驗科，福州350001)

全反式維甲酸(ATRA)用于治療急性早幼粒白血病(APL)和格列衛(STI571)用于治療慢性粒白血病標記著血液系統惡性腫瘤的分子靶點治療時代已經到來。血液系統惡性腫瘤有很多好的分子靶點，而且許多針對這些靶點的新藥正在臨床試驗當中。蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate，Sutent，Su11248)是一種新的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，具有抗腫瘤和抗血管生成的雙重作用。2006年1月FDA批準本品用于甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate，Ggleevec)治療失敗或不能耐受的胃腸道間質瘤患者以及晚期腎細胞癌患者［1，2］，對其他實體瘤的治療應用也已進入Ⅱ期臨床階段，但其與惡性血液病關系的研究尚不多。國外有實驗初步表明用SU11248可以誘導急性髓細胞樣白血病病人部分緩解［3］，因此，本實驗擬以人髓系白血病細胞株HL-60為白血病模型，分析SU11248對白血病細胞HL-60的作用及可能機制，以期為白血病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人髓系白血病細胞株HL-60由福建省血液病研究所傳代保存;SU11248購自biocompound公司，用二甲亞砜溶解，-20℃避光保存備用;RPMI1640培養液為 Gibco公司產品;二甲亞砜 、MTT溶液為Sigma公司產品;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產品;AnnexinV Detection Kit為BD公司產品;凋亡周期檢測試劑盒為北京天來生物醫學科技有限公司產品;HaltTMProtease Inhibitor、Protein Extraction Reagent為 Pierce 公司;bcl-2、bax、caspase-3單克隆抗體 (鼠抗人)、Western blot Luminol Reagent:sc-2048為Santa Cruz公司產品;辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、硝酸纖維膜(NC膜)均由北京中山生物技術公司提供。

1.2 方法

1.2.1 建立細胞培養體系 HL-60細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，2天傳代1次，培養中的細胞密度均保持在(1.0～5.0)×105ml-1，取對數生長期細胞作為實驗用細胞。

1.2.2 MTT比色法檢測SU11248對HL-60細胞增殖的影響 取對數生長期細胞，將其濃度調整為1.0× 105ml-1，分別與終濃度為 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/ml的 SU11248 共培養，以未處理的HL-60細胞為對照，分別接種于96孔板，每孔200 μl，每組設 4 個平行孔，置 37℃、5%CO2飽和濕度條件下進行細胞培養，分別于24、48、72、96小時加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，繼續培養4小時后離心去上清，加入終止液DMSO溶液150 μl/孔，振蕩10分鐘，在酶標儀上用雙波長492 nm和630 nm測定吸光值(OD值)。計算各時間點的細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%，實驗重復3次，取均值。

1.2.3 AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡 收集對照組和 0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248作用48小時 后的HL-60細胞，1/15 mol/L PBS洗滌2次。使用1×binding buffer調整細胞濃度為5×105ml-1。吸取100 μl細胞到 1.5 ml EP 管，加入 5 μl AnnexinV-FITC 和 5 μl PI。室溫下(20℃ ～25℃)避光輕搖孵育15分鐘后，再加入400 μl 1×binding buffer。1小時內避光送流式細胞室檢測。實驗重復3次。

1.2.4 DNA倍體分析及細胞周期分析 收集對照組和2.0 μg/ml SU11248 作用 24、48、72 小時后的HL-60細胞，用 1/15mol/L PBS洗滌細胞 1次(2 000 r/min離心，5分鐘)收集并調整細胞濃度為1×106ml-1，用70%乙醇固定后PBS洗去固定液，加入200 μl RNase A 37℃水浴30分鐘，再加入800 μl PI染色混勻，4℃避光30分鐘，冰浴，避光送流式細胞室檢測。實驗重復3次。

1.2.5 細胞DNA片段化檢測 收集對照組和0.25、2.0、4.0 μg/ml SU11248 作用 48 小時 后的HL-60細胞，1/15 mol/L PBS洗滌細胞2次，加入50 μl細胞裂解緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L，pH7.6;NaCl 100 mmol/L;EDTA 10 mmol/L)，作用16秒，6 600 r/min，離心5分鐘，吸上清于 EP管。加入SDS，調整終濃度為1%，加入RNase A，調整終濃度為1 μg/μl，56℃水溶 2 小時。加入蛋白酶 K，調整終濃度 為2.5 μg/μl，37℃水浴 2小時。加入1/10體積10 mmol/L乙酰胺和2.5體積無水乙醇沉淀DNA，-20℃過夜。12 000 r/min離心5分鐘去上清，沉淀吹干后溶于TE溶液。提取的DNA經1.5%瓊脂糖凝膠(含0.1%EB)電泳，35 V，3小時，紫外燈下觀察結果。

1.2.6 Western blot檢測 bcl-2、bax、caspase-3 蛋白水平的變化 以IC50(2.0 μg/ml)的SU11248作用HL-60細胞后，于24、48、72小時分別提取蛋白，進行Western blot檢測，簡述如下:

收集對照組和2.0 μg/ml SU11248 作用24、48、72小時后的HL-60細胞，每組約5×106ml-1個，離心棄上清，沉淀用1/15 mol/L PBS洗滌2次，去上清(洗滌液要吸干凈)。按1×106細胞/100 μl裂解液+1 μl蛋白酶抑制劑的比例裂解細胞。提取細胞總蛋白。Bradford法(考馬斯亮藍法)，測定蛋白質含量。

20 μg總蛋白進行120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉移至NC膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉1小時。根據蛋白Marker將膜在適當位置剪開，做好標記，分別與相應的一抗(bcl-2鼠抗人抗體，bax鼠抗人抗體，caspase-3鼠抗人抗體)反應過夜。再與相應二抗(1∶2 000羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG)室溫下反應，ECL免疫印跡化學發光試劑放射自顯影，應用計算機圖像掃描分析系統對圖像進行掃描分析，以目的條帶與內參照β-actin的灰度值之比作為目的條帶蛋白的相對表達量，實驗重復4次。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件對所有數據進行統計學分析，多組間均數比較采用方差分析，兩組間比較用 t檢驗，實驗結果用x±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SU11248對HL-60細胞增殖的影響

2.1.1 SU11248對HL-60細胞增殖抑制作用量效關系 不同濃度SU11248作用HL-60細胞48小時后，各實驗組SU11248對HL-60細胞均有抑制作用，細胞增殖反應(OD值)與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，并隨藥物濃度的增加抑制率顯著增高(見表1)。

2.1.2 SU11248對HL-60細胞增殖抑制作用時效關系 2.00 μg/ml SU11248作用 HL-60細胞 24、48、72、96小時后，細胞增殖反應(OD值)均較對照組明顯降低，P＜0.05(見表2)，在72小時抑制率達到最高。

2.2 AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測SU11248對HL-60細胞凋亡影響 對照組、0.25、2.00、4.00 μg/ml SU11248作用HL-60細胞48小時后凋亡率分別為1.30%、4.80%、40.89%、43.71%，藥物組較對照組明顯增高(P＜0.05)且隨藥物作用濃度的增高凋亡率增高(見圖1)。2.3 SU11248對HL-60細胞DNA倍體影響 2.00 μg/ml SU11248作用于HL-60細胞后，G0/G1期細胞比例較對照組(29.51%)高(P＜0.05)，且隨時間增加而明顯增加，24、48、72小時G0/G1期細胞比例分別為47.91%、54.15%、62.41%，而G2期及S期細胞比例均下降，而且在各處理組均可見亞二倍體G1峰(凋亡峰)，如圖2A～D所示。與對照組相比，細胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)。

表1 不同濃度SU11248對HL-60細胞生長的影響Tab．1 Effects of SU11248 with different concentration on cell growth of HL-60 cells

表2 SU11248(2．0 μg/ml)對HL-60細胞在不同時間生長的影響Tab．2 Effects of SU11248 on cell growth of HL-60 cells at different time points

圖1 AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測不同濃度SU11248作用HL-60細胞凋亡率(48小時)Fig．1 Effect of SU11248 on the rate of apoptosis of HL-60 cells detected by flow cytometer with AnnexinV/PI double-stain(48 h)

圖2 DNA倍體分析檢測SU11248作用HL-60細胞不同時間后細胞凋亡率Fig．2 Effect of SU11248 on apopotosis induction in HL-60 cells at different time points with analyzing DNA ploidy

表3 SU11248作用HL-60細胞后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達水平的變化(與內參β-actin蛋白的比值)Tab．3 Expression of bcl-2，bax，caspase-3 protein of HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points(compared with β-actin)

圖3 不同濃度SU11248作用HL-60細胞48小時后DNA Ladder凝膠電泳圖Fig．3 Effect of SU11248 on DNA fragmentation in HL-60 cells with different concentration

圖4 Western blot檢測2．0 μg/ml SU11248 作用 HL-60 細胞后不同時間 β-actin、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表達情況Fig．4 Expression of β-actin，bcl-2，bax，caspase-3 protein in HL-60 cells treated with 2．0 μg/ml SU11248 at different time points

2.4 SU11248對HL-60細胞DNA片段化形成影響瓊脂糖凝膠電泳顯示SU11248作用HL-60細胞48小時后，2.0和4.0 μg/ml處理組出現明顯凋亡特征的DNA改變，即呈典型的DNA降解“梯狀”條帶片段，而在0.25 μg/ml處理組沒有出現明顯的梯帶(Ladder)，對照組細胞基因組DNA完整，見圖3。

2.5 Western blot檢測SU11248干預HL-60細胞前后bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達水平變化 2.0 μg/ml SU11248作用24、48、72 小時后，ECL 熒光顯色實驗中采用β-actin蛋白為內參照以保持蛋白上樣量的一致性。Western blot結果顯示SU11248作用后bcl-2蛋白水平較對照組低，且隨藥物作用時間的延長，蛋白表達逐漸減弱(P＜0.05)，而SU11248作用后caspase-3蛋白水平較對照組升高，隨藥物作用時間的延長表達逐漸增強(P＜0.05)，bax蛋白水平則不發生明顯變化(P＞0.05)，見表3及圖4。

3 討論

SU11248是一種口服的小分子藥物，能夠抑制VEGF-R2、-R3和-R1以及血小板衍生生長因子(PDGFR-β)、KIT、FLT-3 和 RET 的酪氨酸激酶活性，通過特異性阻斷這些信號傳導途徑達到抗腫瘤效應［4，5］。SU11248的抗腫瘤活性已經在各種晚期惡性腫瘤患者中得到證實，包括腎細胞癌、肉瘤、乳腺癌等［6-9］。由于近年來在治療對格列衛無效的腸胃道腫瘤方面顯示了較好的臨床療效，SU11248更加受到了人們的關注，在實體瘤方面已有較多的研究，并取得一定的臨床效果，但在國內外，有關其抗白血病方面的研究鮮見報道，國外有初步實驗表明，SU11248可以誘導白血病細胞凋亡從而使急性髓細胞樣白血病病人部分緩解［3］。本實驗首先通過MTT比色法觀察正常狀態下HL-60細胞的生長特點以及不同濃度SU11248(0.25～8.0 μg/ml)作用HL-60細胞的生長、增殖的改變。研究結果顯示:SU11248對HL-60細胞株具有較強的抑制增殖作用，而且這種抑制作用呈明顯的量效和時效關系。HL-60細胞與不同濃度SU11248共育時，細胞生長明顯受到抑制，IC50約為2.0 μg/ml。DNA有規律地在核小體之間降解形成梯狀帶，是凋亡細胞的重要生化標志。本實驗瓊脂糖凝膠電泳顯示，SU11248能誘導HL-60細胞出現典型的DNA梯狀帶。AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測HL-60細胞凋亡表明SU11248作用的劑量依賴性，隨著作用濃度的升高HL-60細胞凋亡率也隨之增加。DNA倍體分析表明SU11248可誘導HL-60細胞出現典型的亞二倍體峰(凋亡峰)，并且存在明顯的時效關系。本研究結果還顯示SU11248具有細胞周期阻滯作用，可將HL-60細胞阻滯于G0/G1期，阻止細胞進入S期和G2/M期。G1期阻滯是細胞增殖抑制的重要環節，細胞不能進入S期，DNA合成無法完成，干擾了蛋白質代謝，從而抑制了腫瘤細胞的分裂。以上實驗表明，SU11248在體外能抑制HL-60細胞增殖，誘導細胞凋亡，并呈現時間和劑量的依賴性。

為探討SU11248對白血病細胞抑制增殖、誘導凋亡作用的可能機制，本實驗通過Western blot檢測SU11248干預HL-60細胞前后凋亡信號通路分子bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達水平的變化。

研究結果顯示在SU11248抑制HL-60細胞增殖、誘導細胞凋亡過程中bcl-2基因較對照組低且隨著作用時間的延長而逐漸下調，bax基因無明顯變化。提示SU11248可能是通過調節bcl-2家族蛋白中bcl-2蛋白的表達改變抗凋亡分子和促凋亡分子之間的比率最終實現對腫瘤細胞的凋亡誘導作用。Caspase級聯反應被認為是細胞程序性死亡的執行階段，且該反應可被抗凋亡bcl-2家族蛋白分子所拮抗［10］。在探討了SU11248對白血病細胞HL-60中bcl-2家族蛋白bcl-2的調節作用后，本研究進一步考察了SU11248對HL-60細胞中caspase-3的影響。Western blot結果表明，SU11248可以通過促進caspase-3的裂解而激活caspase級聯反應，最終實現對HL-60細胞的凋亡誘導作用。

上述研究結果提示:SU11248作用于人白血病細胞后可以通過誘導bcl-2家族蛋白的改變而促發線粒體釋放細胞色素C，隨后通過裂解caspase-3而激活caspase級聯反應，最終完成了對腫瘤細胞的凋亡誘導作用。總之，調節bcl-2家族蛋白之間的平衡并激發caspase級聯途徑從而通過內部途徑促進凋亡是SU11248在體外發揮抑制人白血病細胞生長、誘導細胞凋亡的可能機制之一。SU11248是否同時還可通過其他凋亡調控途徑發揮抗腫瘤效應及其相應的確切機制，有待進一步的研究。

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